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调节性B细胞在儿童原发性肾病综合征Th17Treg免疫失衡中的作用及机制研究
添加时间: 2018-12-5 12:45:06 来源: 作者: 点击数:

调节性B细胞在儿童原发性肾病综合征Th17Treg免疫失衡中的作用及机制研究

  

第一部分:调节性B 细胞(B10)功能紊乱可通过影响Th17/Treg 免疫平衡,参与儿童原发肾病综合征(PNS)发生、发展及转归

    研究表明:Th17/Treg 细胞免疫失衡及TH17-IL-17 优势活化是儿童PNS 发生、发展的重要机制,而肾脏局部Th17/IL-17 轴异常活化与PNS 对激素治疗敏感性、病理类型及预后密切相关;但是目前对于Th17/Treg 细胞免疫失衡及Th17/IL-17 轴优势活化的调控途径及机制这一重要科学问题,尚不清楚。B10 作为负向免疫调控细胞,在儿童PNS发生、发展及转归中的作用及其具体免疫学机制尚不清楚。故本部分将初探B10及其不同亚群在PNS 患儿外周血中的水平及功能变化及其对Th17/Treg 免疫平衡的影响。

研究对象

     收集XXX医院肾内科住院及门诊治疗的PNS 患儿共60 例,所有病例均符合PNS 诊断符合2009 年中华医学会儿科学分会肾脏病学组制定的儿童常见肾脏疾病诊治循证指南的标准,其中分为原发肾病综合征单纯型(Simple type of nephrotic syndromeSNS),肾炎型肾病综合征(Nephritic type of nephrotic syndromeNNS)。恢复期的单纯型肾病综合征(Simple type of nephrotic syndromein remissionRM-SNS),恢复期的肾炎型肾病综合征(Nephritic type nephrotic syndrome in remissionRM-NNS),收集正常体检儿童外周血20 例。如表所示,正常儿童,急性期SNSNNS 及恢复期SNSNNS 组间在年龄、性别的比较,均无统计学差异(P0.05)。

实验方法

1 外周血单个核细胞(PBMC)的分离抽取

    急性期初发的PNS 患儿、缓解期PNS 以及体检正常儿童的外周静脉血3-6ml,采用肝素抗凝。后再用无菌 PBS 缓冲液(pH 7.20.01M11 稀释充分混匀后,后缓慢加入等体积Ficoll 淋巴细胞分离液液面,常温下离心20min2500r/min)。小心吸取中间Ficoll 液白膜层于10ml 无菌离心管中,加入3ml 无菌PBS 洗涤2 遍(2500r/min×5min),离心后弃上清,再加入含10%FBS RPMI1640 培养基1ml,重悬细胞,混匀后吸取 20μl,再用1%稀盐酸稀释10 倍,显微镜计数后调整细胞浓度为2×109/L,台盼兰染色检测活性。

2 外周血 PBMC 的培养条件分离

    洗涤后的PBMC 用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基混悬至2ml,调整细胞浓度为2×106/ml。充分混匀后平均分为 2 管(1ml/管),一管中加入 LPS(终浓度 10μg/ml)刺激7h,过程中加入PMA(终浓度 50ng/ml),离子霉素(终浓度 500ng/ml),BFA1×)混匀,置于 37℃、5%CO 2 孵箱中培养,用于Th17B10CD19+IL-10+B 细胞)以及 B10 两个亚类(CD19+CD24hiCD38hiB 细胞和CD19+CD24hiCD27+B 细胞)IL-10 分泌水平的检测[15];一管中只加入LPS(终浓度 10μg/ml),置于37℃、5%CO2 孵箱中培养7h,用于Treg 细胞的检测。

3 流式细胞仪(FCM)检测

3.1   Th17 细胞流式检测

1) PBMC 培养5h 后,收集并用无菌PBS 洗涤2 遍,2500rpm×5min,离心弃上清,最后一次剩余约100μl

2) 加入anti-human CD8-FITC anti-human CD3-PerCP-Cy5.5 抗体各5μl,涡旋混匀,4℃避光孵育30min

3) 1ml PBS 洗涤2 遍,2500rpm×5min,离心弃上清,加入500μl 固定/破膜缓冲液4℃避光孵育30min

4) 1ml PBS 洗涤2 遍,2500rpm×5min,离心弃上清,加入提前配好的 1×通透液(通透液原液:ddH20=1:91ml5 分钟后2500rpm×5min,离心弃上清,×2 次,最后一次剩余约100μL,加入 50μl 大鼠血清 4℃避光封闭 20 分钟;

5) 充分涡旋混匀后分为2 管,分别加入10μl anti-human IL-17A-PE 抗体和5μl同型对照 PE-IgG14℃避光孵育30min

6) 1ml PBS 洗涤2 遍,2500rpm×5min,离心弃上清,200μl PBS 重悬细胞,在流式细胞仪上计数5×104 以上细胞。

3.2  Treg 细胞流式检测

1) PBMC 培养5h 后,收集并用无菌PBS 洗涤2 遍,2500 rpm×5min,离心弃上清,后一次剩余约100μL

2) 充分涡旋混匀后分为2 管,一管加入 anti-human CD4-FITC 抗体10μl anti-human CD25-PE 抗体5μl,一管加入anti-human CD4-FITC 10μl 和同型对照PE-IgG1 2.5μl 涡旋混匀,4℃避光孵育30min

3) 1ml PBS 洗涤2 遍,2500 rpm×5min,离心弃上清,加入 500μl 固定/破膜缓冲液 4℃避光孵育30 min

4) 1ml PBS 洗涤2 遍,2500 rpm×5 min,离心弃上清,加入提前配好的 1×通透液(通透液原液:ddH2 0=1:91ml5 分钟后2500rpm×5min,离心弃上清,×2 次,最后一次剩余约100μL,加入50μl 大鼠血清 4℃避光封闭20 分钟;

5) 充分涡旋混匀后双抗体管再分为2 管,分别加入5μl anti-human Foxp3-APC抗体和 2.5μl 同型对照APC-IgG14℃避光孵育30min

6) 1ml PBS 洗涤2 遍,2500rpm×5min,离心弃上清, 200μl PBS 重悬细胞,在流式细胞仪上计数5×104 以上细胞。

4 统计学方法

    应用Graphpad Prim 5.0 进行数据统计分析,两个变量之间的相关性分析用Spearmans rank 相关分析;各组之间的比较先进行方差齐性Bartlett’s test 检验,方差齐者各组比较用 One-way ANOVA Tukey test,结果以均数±标准误(Mean± SEM)表示,P<0.05 为差异有统计学意义。

第二部分:CD40/CD40L 信号通路对儿童PNS 外周血调节性B 细胞(B10)分化及功能成熟的影响

    本部分研究旨在探讨影响PNS 外周血B10 细胞分化及功能成熟的信号通路,及CD40/CD40L 信号通路对PNS 患儿外周血B10 细胞分化及功能成熟中的作用,及其进一步对Th17 细胞、Treg 细胞分化和Th17/Treg 免疫平衡的影响。

实验对象

1)研究对象 同第一部分

2)实验组分组

实验方法

1 外周血单个核细胞(PBMC)的分离同第一部分

2 外周血 PBMC 的培养条件分离洗涤后的PBMC 用含10%胎牛血清的 RPMI1640 培养基混悬至 2ml,调整细胞浓度为2×106/ml。加入LPS(终浓度10μg/ml)刺激7h,过程中加入PMA(终浓度50ng/ml),离子霉素(终浓度 500ng/ml),BFA1×)混匀,置于37℃、5%CO2 孵箱中培养,用于CD19+B 细胞及其IL-10 表达水平的检测(B10 细胞)。另一部分分离洗涤后的 PBMC 用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基混悬至2ml,调整细胞浓度为2×106 /ml。充分混匀后平均分为2 管(1ml/管),一管中加入CpGODN2006,终浓度 10 μg/ml),CD40L(终浓度1μg/ml),一管中加入CpGODN 2006,终浓度10 μg/ml),anti-CD40L mAb(终浓度1μg/ml),置于37℃、5%CO2 孵箱中培养48 h,用于Treg 的检测;在培养的最后5 h,加入PMA(终浓度50ng/ml)、离子霉素(终浓度500ng/ml)和BFA (1×solution) ,用于B10pro+B10 细胞(CD19+CD10+B 细胞)、CD19+CD24hiCD38hi IL-10+B 细胞,CD19+CD24hiCD27+IL-10+B 细胞和Th17 细胞的检测。

3 流式细胞仪(FCM

1. CD19 + B 细胞及其 IL-10 表达水平的检测

1PBMC 培养5h 后,收集并用无菌PBS 洗涤2 遍,2500rpm×5min,离心弃上清,最后一次剩余约100μL;(2)加入anti-human CD19-APC 抗体5μl,涡旋混匀,4℃避光孵育30min;(31ml PBS 洗涤2 遍,2500rpm×5min,离心弃上清,加入 500μl 固定/破膜缓冲液4℃避光孵育 30min;(41ml PBS 洗涤2 遍,2500rpm×5min,离心弃上清,加入提前配好的1×通透液(通透液原液:ddH2 0=1:91ml5 分钟后2500rpm×5min,离心弃上清,×2 次,最后一次剩余约100μL,加入50μl 大鼠血清4℃避光封闭20 分钟;(5)充分涡旋混匀后分为2 管,分别加入5μl anti-human IL-10-PE 抗体和 2.5μl同型对照PE-IgG14℃避光孵育30min;(61ml PBS 洗涤2 遍,2500rpm×5min,离心弃上清, 200μl PBS 重悬细胞,在流式细胞仪上计数5×104 以上细胞。

2.Th17 细胞流式检测同第一部分。

3.Treg 细胞流式检测同第一部分。

4.B10pro+B10 细胞,CD19+CD24hiCD38hiB 细胞和CD19+CD24hi CD27+B 细胞及其 IL-10 表达水平的检测同第一部分。

4 统计学方法

    应用统计软件Graph pad Prim 5.0 进行相关数据的统计分析,两个变量之间的相关性分析用Spearman’s rank 相关分析;各组间比较,先进行方差齐性Bartletts test 检验,方差齐者各组比较用 One-way ANOVA Tukey 检验,结果以均数±标准误(Mean±SEM)表示,P<0.05 为差异有统计学意义。

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