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OncoE6、p16/Ki-67表达与HPV感染的相关性及其在宫颈癌筛查中的应用研究
添加时间: 2019-4-14 16:56:56 来源: 作者: 点击数:

OncoE6p16/Ki-67表达与HPV感染的相关性及其在宫颈癌筛查中的应用研究

报告正文

一、立项依据与研究内容

(一)项目的立项依据

子宫颈癌是危害全球女性健康和生命的主要恶性肿瘤之一。最新的世界范围统计显示,2013年全球有48.5万宫颈癌新发病例,23.6万死亡病例,且85%的发病和死亡发生在发展中国家(Fitzmaurice et al.2015)。我国死因回顾调查显不19731975年宫颈癌世界人口标化死亡率为14.61/10万,尽管这一数据在90年代随着国家经济水平的改善有所下降,但宫颈癌的危害依然严重(杨玲等,2003);值得注意的是,19892008年全国宫颈癌的发病率无论是城市还是农村均呈上升趋势,分别在19971999年后以平均每年14.4%22.5%的速度递增佛尚英等,2014)。全国肿瘤防治办公室最新发表,基于20092011年全国72个肿瘤登记点的研究数据显示,2015年我国预计有9.89万宫颈癌新发病例,3.05万死亡病例,且多分布在欠发达的中西部(Chen et al.2016)。此外,近十年来在全国十几个省市、地区开展的宫颈癌及癌前病变流行病学调查结果思示,子宫颈癌前病变及癌的患病率(2.5%)和高危型HPV的人群感染率(16%)都很高(Zhao et al.2012)。这些证据均提示了我国宫颈癌防治工作的迫切性。

高危型HPV持续感染是宫颈癌发生的必要因素。在高危型中,以HPV1618型感染率最高,在宫颈癌中高达70-85%(Chen et al.2009de Sanjose et al.2010)HPV感染和宫颈癌病因学关系的确定,促进了HPV预防性疫苗的诞生和HPV类检测技术的发展。HPV疫苗为基础的一级预防,可以从源头上阻断子宫颈癌的发生。尽管预防性HPV疫苗己在世界上超过140多个国家获批,但在中国,不管是国外的疫苗,还是国内自主研发的疫苗,都仍处于三期临床试验阶段,短期内并不能在我国女性中使用(WHO2014)。因此,以筛查为基础的二级预防是目前我国宫颈癌预防的主要手段。在发达国家,以细胞学为基础的筛查体系的建立大大降低了宫颈癌的发病率和死亡率。在我国,宫颈癌筛查工作始于2005年两个全国子宫颈癌早诊早治示范基地的建立,随后在2006-2008年间政府又以中央财政转移地方支付的形式资助了全国43个宫颈癌筛查试点(董志伟等,2009),并在2009年将农村女性的两癌筛查纳入了国家重大公共卫生服务项目,在2009-2011年间为一千万适龄农村女性提供了免费的宫颈癌检查。从20122015年,该项目己涵盖了三千万农村女性,即便如此,离覆盖所有适龄女性的目标差距仍然很大,而我国现有的卫生服务能力并不足以支持如此大规模的人群筛查。

液基细胞学检查自1999年引进我国以来己成为宫颈癌筛查的重要手段,但这仅限于经济水平高的城市地区,在一些卫生资源度乏、基础设施差、细胞学医生稀缺的农村地区,很难建立完善的细胞学筛查体系。高危型HPVDNA检测具有灵敏度高、客观性强等优点,有望替代细胞学成为农村地区宫颈癌筛查的主要方法(Zhao et al.2010),但所有的HPV DNA检测技术都不能有效区分一过性和持续性感染,造成了不必要的阴道镜转诊和卫生资源的浪费。鉴于我国地域经济发展和人口分布不平衡的特点,要完成如此大规模的宫颈癌筛查,急需一些简单、高效的新技术来解决此瓶颈问题。

病因学研究提示HPV E6癌蛋白在病毒由一过性感染发展为持续感染进程中起重要作用(Ghittoni et al.201巧,而持续感染是宫颈癌前病变和癌症发生的必要因素,能够将有转化潜力的持续感染从一过性感染区分出来使得HPV E6癌蛋白的检测极具意义。由美国Arbor Vita公司研发OncoE6癌蛋白检测技术(AVCSunnyvaleCAUSA)是一种"试纸条检测"形式的捕获实验,可在2.5个小时内分别检出HPV1618E6癌蛋白,且具有成本低、操作简单和易于实施等优点。鉴于其前期研究数据有限,目前还需进一步研究对其应用效果进行评价。

细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂P16 INK4a (P16) cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F细胞周期调节途径中起负性作用,离危型HPV—过性感染向持续感染转化引起的细胞周期调控素乱可能引起p16的过表达,因此,其被认为是宫颈癌筛查的潜在分子标志物(Wentzensen et al.2007Liao et al.2014)。但是,p16在正常细胞中也有表达,且染色结果的判断标准多种多样,限制了其在筛查中的广泛应用。Ki-67是细胞核抗原,可在除G0期外的细胞周期表达,是细胞增值的标志。在正常细胞中,p16Ki-67不可能同时表这,而两者的同时表达提示了细胞周期调控失调。美国罗氏公司研发的CINtec PLUS技术(RocheTucsonAZUSA)能够同时检测细胞学标本中的p16Ki-67蛋白,且结果判断不依赖于形态学检查,有一个细胞同时有P16Ki-67着色即可判断为阳性,大大的降低了对细胞学医生的要求。前期研究显示CINtec PLUS技术能够有效的检出宫颈癌和癌前病变(Ikenberg et al.2013),但目前尚未经过国内人群的验证。

是否能将OncoE6CINtec PLUS这两种新型检测技术应用于我国女性的宫颈癌筛查项目中,需要解决以下两个问题:(1)尽管病因学上认为这两项指标很可能与髙危型HPV持续感染相关,但目前尚无流行病学的证据,故需从流行病学角度证实其相关关系,即指标的有效性;(2)由于两项技术在中国人群中的研究数据不足,需大规模的人群验证其筛查效果如何,即技术的实用性。

为解决上述问题,我们首先在一项低成本子宫颈癌分子技术筛查方法研究(LCMCCSS)的队列人群中,探讨了HPV16/18E6癌蛋白和p16/Ki-67表达与商危型HPV持续感染的关系,然后在以医院为基础的多中也研究中,评价了这两项检测技术在人群中的筛查效果,为全面促进我国女性的子宫颈癌防治工作提供依据。

(二)项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。

.主要研究内容

本课题拟于2019年采用6种方法(包括HPV16/18 E6癌蛋白检测(OncoE6)、高危型HPV检测及VIA)联合筛查宫颈癌,将所有筛查阳性者及约10%筛查阴性者转诊进行阴道镜检查和组织活检。2022年,对所有转诊人群进行随访,收集标本完成OncoE6p16/Ki-67(CINtec PLUS)和高危型HPV检测,利用基线和随访数据分析HPV16/18 E6癌蛋白、p16/Ki-67表达与高危型HPV持续感染的关系。课题设计一个以医院为基础的多中心研究,收集到医院进行宫颈癌筛查妇女和病理确诊为CIN2+妇女的标本,进行OncoE6CINtec PLUSLBC和高危型HPV检测,评价OncoE6CINtec PLUS对总人群、细胞学诊断为ASCUS及以上人群和HPV DNA阳性人群中宫颈癌前病变和癌的检出能力。

.研究目标

1)探讨HPV16/18 E6癌蛋白、p16/Ki-67表达与高危型HPV持续感染的关系。

2)评价HPV16/18 E6癌蛋白、p16/Ki-67表达用于宫颈癌筛查的效果,为其在我国女性宫颈癌筛查项目中的推广应用提供参考依据。

.拟解决的关键科学问题

1) 通过对LCMCCSS研究队列人群的三年随访,探讨HPV16/18 E6癌蛋白、p16/Ki-67表达与高危型HPV持续感染的关系。

2) 在医院为基础的多中心研究中,评价HPV16/18 E6癌蛋白检测技术(OncoE6)p16/Ki-67检测技术(CINtec PLUS)对我国女性CIN2+CIN3+病变的检出能力,比较不同分流方法对ASCUS及以上人群及HPV阳性人群中CIN2+CIN3+病变的检出效果,探讨筛查阳性人群的管理方法。

(三)拟采取的研究方案及可行性分析。

.研究方法

LCMCCSS研究流程

1)基线筛查

首先,研究人员对招募者进行集体宣教,详细阐述本研究的目的和意义,参加本研究的潜在利益和风险,整个筛查流程和注意事项等。在充分知情的前提下,愿意参加本研究者签署书面知情同意书。研究人员登记研究对象的基本信息,并为其分配一个唯一的ID号作为本研究的标识。随后,进行身高、体重巧血压的测量及妊娠试验。在标本收集前,由经过培训的当地调查员对研究对象进行一对一的危险因素调查,包含人口学信息、吸烟饮酒史等。上述各项完成后,在医务人员的口头指导下,研究对象自行使用锥形宫颈刷(Qiagen)采集一份子宫颈阴道分泌物标本,放入DCM缓冲液(Qiagen)中保存,用于自我取样的care HPVHC2检测,采样刷长约15厘米,采集方法如下:手持采样刷柄部上方,伸入阴道内直到遇到阻力后,旋转3-5圈后取出。然后,妇科医生通过窥器扩开阴道,先后使用棉签(AVC)和锥形宫颈刷(Qiagen)在子宫颈鱗柱交界处旋转多次,采集两份子宫颈脱落细胞标本。将第1份标本放入干的冻存管中,用于OncoE6的检测;第2份标本放入DCM缓冲液中保存,用于医生取样的careHPVHC2检测,标本采集完成后进行VIA检查。在初筛结束1-2周后,对任意一项或多项阳性的妇女和随机抽取的10%六项筛查均为阴性的妇女进行召回,用宫颈采样刷(Hologic)采集脱落细胞标本,放入液基细胞学PreservCyt储存液(Hologic)用于cobasHPV检测,采集方法如下:手持采样刷上端,将刷子插入颈管1-1.5cm,直到刷于头部的最大外围接触到子宫颈外口,顺时针旋转1圈,然后用刷子轻轻的在宫颈外曰刷完后取出,取样完成后进行阴道镜检查(包含VIAVILI染色)和组织活检。

2)人群随访

对基线筛查召回的妇女进行随访,主要包括:

1.基线筛查阳性且未进行宫颈切除者;2.基线随机抽取的约10%需要参与召回访视的筛查阴性者。研究人员向需要参加随访的研究对象解释她们的基线筛查结果,并说巧随访的原因。在知晚研究流程,签署知情同意书后,由妇科医生用棉签(AVC)收集2份标本放入冻存管中,用于OncoE6的检测;然后用宫颈采样刷(Hologic)收集宫颈脱落细胞,放入PreservCyt储存液(Hologic)中,用于cobas HPV、液基细胞学和CINtec PLUS检测。在四项检测完成后,对任一项或多项检查阳性的妇女进行召回,进行阴道镜检查(包含VIAVILI染色)和组织活检。

基线和随访流程及人群纳入情况见图1

1LCMCCSS研究基线和随访流程图

以医院为基础的多中心研究流程

该部分的研究对象包含两部分。一部分为宫颈癌筛查组的纳入,研究对象为到医院体检中心进行宫颈癌筛查的妇女。首先,由项目研究人员对符合纳入标准的研究对象进行宣教,介绍项目研究流程,研究对象在充分了解项目并签署知情同意书后纳入研究。之后,由经过培训的工作人员进行一对一的问卷调查,内容包括一般人口学信息、吸烟饮酒史等。标本的采集由经过培训的妇科医生完成,首先用棉签(AVC)采集2份标本放入冻存管中,用于OncoE6的检测;然后用宫颈采样刷(Hologic)采集宫颈脱落细胞,放入Preserv Cyt储存液(Hologic)中,用于cobasHPV、液基细胞学和CINtec PLUS检测。在四项检测完成后,对任一项或多项检查阳性的妇女进行召回,进行阴道镜检查(包含VIAVILI染色)和组织活检。另一部分为转诊组(CIN2+)的纳入,研究对象为各中也活检病理学诊断为CIN2+的妇女。经研究人员判断对象符合纳入标准后,在宣教并签署知情同意书后,于妇女手术或治疗前,由工作人员和妇科医生分别进行问卷调查和标本收集,标本收集保存方法与宫颈癌筛查组相同。所有中也的标本都统一在CICAMS中也实验进行检测。

 

2 宫颈癌筛查组流程图

 

 

 

3转诊组流程图

实验室检测方法

LCMCCSS基线研究中,收集的第一份棉签标本用于OncoE6检测,第二份自取样标本用于自我取样的careHPVHC2检测,第三份医生收集的标本用于医生取样的careHPVHC2检测,召回访式收集的液基细胞学标本用于cobas HPV检测;随访研究中,收集的第一份棉签标本用于〇ncoE6检测,第二份液基细胞学标本先分出1ml用于cobas HPV检测,剩余标本在做完液基细胞学检测后,进行CINtec PLUS染色。

在以医院为基础的多中心研究中,标本处理流程与LCMCCSS随访研究相同,即先收集棉签标本用于OncoE6检测,再收集液基细胞学标本分别用于cobas HPVLBCCINtec PLUS检测。

临床诊断

1 VIA检查

VIA检查的具体操作方法如下:将浸透5%稀释醋酸溶液的棉球均匀敷在子宫颈表面,等待1分钟让醋酸被充分吸收后,取下棉球,在100瓦的白巧灯下观察子宫颈,主要查看靠近鱗柱交界处的转化区上皮,根据醋白上皮的厚度、范围、表面形态和浑浊度等做出初步诊断。

VIA结果判断的标准如下:阴性为无白色改变,或远离转化区出现白色改变,或白色上皮出现慢、消退快、呈现薄的并且不致密的白色;低度病变为淡而浅的白色病变,可在鱗往交界处或交界外;高度病变表现为厚的白色病变、边界明显,且其中一边总在鱗柱交界上;癌为白色病变表面不规则,厚而脆的肿块。我们将所有低度及低度以上病变视为VIA阳性。检查结果按4个象限(即根据时钟点数将子宫颈分为4个象限:12-3点为第一象限,3-6点为第二象限,6-9点为第H象限,9-12点为第四象限)分别记录。

2.阴道镜检查及组织活检

根据研究程序转诊的妇女,按如下步骤进行阴道镜检查,其步骤为:将窥阴器轻轻置入阴道,充分暴露宫颈阴道部和阴道夸塵部;用盐水棉球轻拭去粘液和分泌物,切勿重擦,以免引起出血;肉眼检查宫颈形态、大小、色泽,有无糜烂、白斑、黎生物等,并注意分泌物性质及阴道穹窿况;调节焦距(20-30cm)后初步检查宫颈,用5%的醋酸棉球浸湿于宫颈表面约30-60秒或用棉棒将醋酸溶液不断淋湿宫颈表面,使组织肿胀,轻轻去除粘液,以利观察;用2.5%的破液涂于宫预表面,观察宫颈着色情况;调节放大倍数常用6-15倍,全面观察整个宫颈和阴道弯塵部上皮和血管变化。

活检原则如下:当阴道镜结果为阳性时,医生直接在异常上皮处取活检,即直接活检;当阴道镜结果为阴性时,由另一名工作人员告知医生受检者的初筛结果。若初筛结果为阳性,则进行随机活检,即在子宫颈銳柱交界处的24810点处取活检,同时行ECC;若初筛结果为阴性,则不取活检。将组织活检标本浸泡在10%中性福尔马林缓冲液中固定,进行包埋、切片、染色和阅片。LCMCCSS基线和随访研究的所有标本都在CICAMS进行处理,以医院为基础的多中也研究标本在各研究中心进行处理。

3.免疫组织化学染色

我们采用HE染色法对组织切片进行染色和诊断,因该法应用很广,详细步骤不再赞述。对于诊断不确定的病例,我们采用p16PR免疫沮织化学染色法进行辅助诊断。p16是一种抑癌基因,p16蛋白在细胞周期中通过抑制CDK4/6cyclinD的结合而起着负调控的作用,采用免疫化学染色法检测组织中p16蛋白的表达情况可用于宫颈癌及癌前病变的辅助诊断。PR免疫组化染色可以用于子宫内膜腺癌和宫颈腺癌的鉴别诊断,子宫内膜腺癌中PR常阳性,而宫颈腺癌中PR多为阴性。下面是两种染色方法的详细步骤。p16免疫组织化学染色:所需试剂包括抗原表位修复溶液,洗液,底物-色原体溶液(DAB),盐酸酒精,37mmol/L的氨氧化钱,抗体。

4.组织病理学诊断

所有的活检、ECC和手术标本进行组织病理学诊断。病理诊断采用CIN命名系统,结果包括:阴性(包括:慢性宫颈炎、宫颈息肉、HPV感染相关性病变等)CIN1(病变累及鱗状上皮的下1/3)CIN2(病变累及鱗状上皮的2/3)CIN3 (病变累及鱗状上皮全层)、微小浸润癌、鱗状细胞癌、原位腺癌和腺癌。两项研究中,将所有筛查阴性并且未进行阴道镜检查者(包括筛查阴性并且阴道镜检查阴性者)均视为最终结果阴性;将筛查阳性并且未进行阴道镜检查(包括未取组织活检)者均视为最终结果不完整。

LCMCCSS研究中,基线的病理诊断首先由2名中国的病理医生独立阅片,结果不一致时,讨论后给出一致的诊断结果。诊断过程中,两名病理医生均不知道受检者的基本信息、临床检查结果和实验室检测结果。我们将所有中国的组织病理学诊断结果为CIN2+的标本均送往美国,由美国的1名病理学医生再次阅片后得到美国的沮织病理学诊断结果。对于中国和美国不一致的诊断结果,我们开展了读片会,经过讨论得到了质控后的最终结果。随访的病理诊断由CICAMS 1位有经验的病理医生阅片确定。以医院为基础的多中也研究中,所有的病理诊断首先由各中也病理医生阅片确定。研究结束前,挑出所有CIN病例、HPV检测阴性的鱗癌病例和所有腺癌病例,将其HE染色玻片送至CICAMS,并做空白免疫组化玻片在CICAMS进行p16染色(腺癌标本增加P民染色),由CICAMS病理医生在p16/P民染色辅助下重新阅片诊断。对于不一致的诊断结果,我们开展了读片会,邀请各中也病理医生参加,经讨论得到最终结果。

统计学分析

本研究中,定量资料若满足正态分布,采用均数和标准差进行描述,不同组间的比较采用t检验或者方差分析。定性资料采用百分比或者率进行描述,不同组间的比较根据资料类型的不同,进行独立样本卡方检验(当实际频数小于40时采用Fisher's精确概率法)或配对卡方检验。

采用趋势卡方检验分析各组率之间是否存在升高或降低的趋势。采用非条件Logistic回归模型进行HPV16/18 E6癌蛋白表达与病毒持续感染,p16/Ki-67表达与高危型HPV持续感染/感染的关系分析,计算各变量的相对危险度(RR)、比值比(OR)及其95%可信区间(95%CI)。在进行多因素Logistic回归分析时,纳入单因素分析中有意义的变量进行调整。

在对OncoE6CINtec PLUS进行筛查效果评价时,我们以组织病理学诊断作为金标准,分别以 CIN2+CIN3+作为疾病终点,计算各初筛和分流方法检出病变的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。

灵敏度=A/(A+C) X 100%特异度=D/(B+D) X 100%

阳性预测值=A/(A+B) X 100%阴性预测值=D/(C+D) X 100%

我们采用配对卡方检验对筛查方法的灵敏度和特异度进行相互比较,在进行多组的两两比较时,采用Bonfeironi法对检验水准进行相应的调整,即调整后的检验水准(a ')=原检验水准(a)/比较次数(n)。另外,我们对筛查和分流方法的检出效果进行了受试者工作特征(ROC)曲线分析,计算了ROC曲线下面积(AUC)

.关键技术说明:

1.HC2检测

HC2检测于2003年获得美国食品药品监督管理局批准,是首个可用于宫颈癌筛查的HPVDNA检测技术。其基本原理是采用微孔板化学发光法进行信号放大。该技术可定性检测13种高危型HPV DNA,包括:HPV16183133353945515256585968,不能具体分型。含有目标DNA的样本与特异的HPV RNA混合探针杂交,形成RNADNA杂交子,被微孔板表面包被的抗RNADNA特异抗体捕获。之后,捕获固定的杂交子与碱性磷酸酶交联的抗RNADNA抗体反应,对化学发光底物进行检测。每个抗体分子可交联多个碱性磷酸脂酶分子,每个捕获的杂交体能够与多个交联抗体结合,引起信号的放大。当碱性磷酸脂酶裂解底物后发光,通过照度计可以测量出其光信号强度。发射出的光信号强度代表了样本中是否存在目禄DNA及其相对含量。当样本的相对光强度值等于或大于阔值时(RLU/CO>1.0),意味着样本内含有足够量的HPVDNA,此样本被确定为阳性;而当样本的相对光强度值小于阔值时(RLU/CO<1.0),则意味着样本内不含HPV DNAHPV DNA含量极低,此样本被确定为阴性。

2.careHPV检测

careHPV检测原理与HC2相似,也是通过荧光信号放大的方式,在微孔检测板上进行检测,可定性检出14种高危型HPVDNA,分别为HPV1618313335394551525658596668。该法也不能分型。当样本中含有所测型别的HPVDNA时,DNA与混合探针中的互补性RNA杂交,形成RNADNA杂交子。载有抗RNADNA杂交子抗体的磁珠将RNADNA杂交子捕获。之后,含有碱性磷酸酶的抗RNADNA杂交子抗体与被捕获的RNADNA杂交子偶合。经清洗,去掉非偶合物质后,在磁珠上留下按比例偶合的含有碱性磷酸酶的抗RNADNA杂交子抗体,这一比例与杂交的HPVDNA量一致。最后,磁珠上偶合物中的碱性磷酸酶与底物反应,使底物水解发光,所发出的荧光强度既与存在的碱性磷酸酶量成正比,也与存在的HPVDNA杂交量成正比。底物所发出的光信号经荧光光度计判读,当样本的相对光强度值等于或大于阀值时(RLU/CO>1.0),意味着样本内含有足够量的HPVDNA,此样本被确定为阳性;而当样本的相对光强度值小于阈值时(RLU/CO<1.0),意味着样本内不含HPVDNAHPV DNA含量极低,此样本被确定为阴性。

3. cobasHPV检测

cobas 4800检测主要包括两个过程,首先对细胞及HPVDNA进行提取,然后通过HPVβ-球蛋白引物扩增目标DNA序列,扩增的目标DNA序列与其相应的英光探针结合,该检测的荧光探针有四种,包括HPV16HPV18β-球蛋白和12种高危HPV(313335394551525658596668)混合探针,各探针分别用不同的荧光染料标记,通过实时监测荧光信号确定样本中HPY的种类和含量。在一次试验中,能够同时检测14中高危HPV型,并能分出HPV16/18型。

4. OncoE6检测

OncoE6检测是一种测试髙危型HPV1618E6癌蛋白的快速检测技术。通过试纸条可以半定量的检出HPV1618型的E6蛋白,并提供具体的型别信息。当标本中含有所测型别的HPV E6蛋白时,细胞裂解产物被含有相应型别的抗E6蛋白单克隆抗体捕获,经过洗緣与展开,被抗体捕获的细胞裂解产物与碱性磷酸结合抗体混合物通过毛细作用吸至检测条带上,经过抗原抗体反应固定在检测条带的相应位畳,并在条带上出现紫红色的"检测线",通过比色板可以判断E6蛋白的相对含量。除2条检测线之外,还有1条控制线以判断检测结果的有效性。

5.液基细胞学检查

传统的巴氏涂片是将宫颈样本涂在载玻片上并固定,而液基细胞学是将宫颈样本洗入装有特殊保存液的小瓶中,通过液基制片系统制片。目前常用的制片系统有Thin PrepSure Path两类。本研究中采用的Thin Prep制片系统(Hologic)。在细胞学实验室,将盛有样本的保存液小瓶与一张载玻片和一个一次性过滤器先放入制片机中程序化制片:首先标本被混匀,细胞与粘液、血液、炎症细胞分离开;然后,在负压作用下细胞被提取到控制细胞密度的过滤膜上,过滤膜上的细胞再被转至载玻片上制成涂片;最后将涂片放入%%酒精中固定。与传统己氏染色相比,有以下优点:通过漂洗取样刷,保留了几乎取到的所有细胞;减少了血液、粘液和其他碎片对细胞的覆盖;标本通过湿固定,结构比较清晰;制各的涂片细跑单层平铺很少重叠;涂片制备后,剩余的标本还可用于别的检查。这一技术使得细胞学涂片的不满意率大幅降低。

6 CINtec PLUS检测

CINtec PLUS技术是一种免疫细胞化学检测法,可同时检测宫颈细胞学样本中的和Ki-67蛋白。在正常的细胞周期中,作为抑制增殖的p16与作为增殖指数的Ki-67应该是互相排斥的,无法在同一个细胞周期表达。如果在单个的细胞中检测到这两个蛋白的同时表达,提示细胞周期失调。CINtec PLUS技术采用即用型单克隆—抗鸡尾酒试剂检测上述蛋白,该试剂含有直接针对人p16蛋白(克隆E6H4?)的鼠单克隆抗体和直接针对人Ki-67蛋白(克隆274-11 AC3)的重组兔—抗。经过细施调理、抑制内源性过氧化物酶活性并与—抗鸡尾酒一起赔育后,采用下两种针对宫颈细胞学样本优化的即用型检测系统进行检测,一是共价连接到HQ半抗原(专利性半抗原)和抗HQ半抗原HQ的羊抗鼠二抗,为检测鼠单克隆抗体克隆E6H4优化的辣根过氧化物酶(HRP)连接的三抗;二是共价连接到NP半抗原(专利性半抗原)和抗NP半抗原的羊抗兔二抗,为检测兔重组抗体克隆274-11优化的碱性磷酸(AP)连接的;抗。而后发生的显色反应则是基于HRP介导33'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)转化和对AP-介导的快红与萘酚磷酸盐的转化,分别在p16抗原位点上产生栋色沉淀,在Ki-67抗原位点上产生红色沉淀。经过自动化复染和发蓝反应后,完成两步封固过程,第一步为使用液体封固剂来封装载载片,然后使用永久性封固剂为载玻片加上盖玻片,最后通过光学显微镜评估染色结果。

.技术路线

基线和随访流程及人群纳入情况见图1

1LCMCCSS研究基线和随访流程图

以医院为基础的多中心研究流程,该部分的研究对象包含两部分。一部分为宫颈癌筛查组的纳入,研究对象为到医院体检中心进行宫颈癌筛查的妇女(见图2)

另一部分为转诊组(CIN2+)的纳入,研究对象为各中也活检病理学诊断为CIN2+的妇女(见图3)。经研究人员判断对象符合纳入标准后,在宣教并签署知情同意书后,于妇女手术或治疗前,由工作人员和妇科医生分别进行问卷调查和标本收集,标本收集保存方法与宫颈癌筛查组相同。所有中也的标本都统一在CICAMS中也实验进行检测。

 

2 宫颈癌筛查组流程图

 

 

 

3转诊组流程图

4.可行性分析

(四)本课题的特色与创新之处

由美国Arbor Vita公司研发OncoE6癌蛋白检测技术(AVCSunnyvaleCAUSA)是一种“试纸条检测”形式的捕获实验,可在2.5个小时内分别检出HPV1618E6癌蛋白,且具有成本低、操作简单和易于实施等优点。鉴于其前期研究数据有限,目前还需进一步研究对其应用效果进行评价。前期研究显示CINtec PLUS技术能够有效的检出宫颈癌和癌前病变(Ikenberg et al.2013),但目前尚未经过国内人群的验证。是否能将OncoE6CINtec PLUS这两种新型检测技术应用于我国女性的宫颈癌筛查项目中,需要解决以下两个问题:(1)尽管病因学上认为这两项指标很可能与高危型HPV持续感染相关,但目前尚无流行病学的证据,故需从流行病学角度证实其相关关系,即指标的有效性;(2)由于两项技术在中国人群中的研究数据不足,需大规模的人群验证其筛查效果如何,即技术的实用性。为解决上述问题,课题首先在一项低成本子宫颈癌分子技术筛查方法研究(LCMCCSS)的队列人群中,探讨HPV16/18E6癌蛋白和p16/Ki-67表达与高危型HPV持续感染的关系,然后在以医院为基础的多中也研究中,评价这两项检测技术在人群中的筛查效果,为全面促进我国女性的子宫颈癌防治工作提供依据。

(五)年度研究计划及预期研究结果

1.年度研究计划

2.预期研究结果

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