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黑根霉脂肪酸脱饱和酶的底物选择性及催化机制的研究
添加时间: 2019-4-14 16:58:29 来源: 作者: 点击数:

报告正文

一、立项依据与研究内容

(一)项目的立项依据

脂肪酸脱饱和酶对维持生物体内脂肪酸的正常代谢、生物膜的正确结构和生理上起着重要的作用[1]。近年以研究脂肪酸脱饱和酶为主的植物油基因工程、植物抗寒育种和食品应用工程等正日益成为热点。Δ6-脂肪酸脱饱和酶是产生γ-亚麻酸和其他一些重要生理物质的关键酶,是一类引入双键靠羟基定向的脂肪酸脱饱和酶。早期对Δ6-脂肪酸脱饱和酶的研究主要集中在动物体内。虽然较早从鼠肝中分离了Δ6-脂肪酸脱饱和酶[2],但由于对膜的结构缺乏了解,所以对Δ6-脂肪酸脱饱和酶(FADS6)的研究一直没有重要的进展。1993Reddy等人第一次从产GLA的蓝细菌中克隆到Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因,并在Δ6-脂肪酸脱饱和酶缺陷的蓝细菌中获得功能表达[3],从而推动了对Δ6-脂肪酸脱饱和酶的分子水平研究。目前,国外一些实验室通过CDNA文库、CDNA末端扩增等方法已经从多种生物中克隆了Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因,并在烟草、油菜、大豆等生物中获得功能表达[4~8],有效增加了这些作物的抗寒性。对已报道的Δ6-脂肪酸脱饱和酶氨基酸序列比较发现,Δ6-脂肪酸脱饱和酶具有3个保守的组氨酸区(Histidine-rich region),即HisIHisIIHisIII,有2个疏水区[9],设计相应的简并引物,通过PCR扩增,克隆、测序得到黑根霉R306Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的核心序列。如何从这段已知的序列出发得到基因的上游和下游序列,是基因克隆中的关键所在。经典的RACEInvitrogen公司等的新RACE方法,虽然可得到未知的上下游序列,但工作量较大,且易造成RNA的降解。反向PCR(Inverse PCR)是用适宜的限制性内切酶消化DNA后,再将DNA环化作为模板,用与核心区两侧互补的引物进行PCR,引物从核心区出发,向两侧的未知序列进行[10]

多不饱和脂肪酸(PUFAs)在细胞膜功能和细胞信号传导中起着重要的作用,很多研究表明 ω3 PUFAs 有益于癌症和心血管疾病的预防。PUFAs 的传统来源深海鱼油由于过度捕捞和日益严重的环境污染,已不能满足持续增长的 ω3 PUFAs 的市场需求。产油微生物作为ω3 PUFAs的替代资源已经成为当前 PUFAs 领域的研究热点。在 PUFAs 的生物合成中,它是由一系列脂肪酸脱饱和酶和延长酶催化产生的。脂肪酸脱饱和酶可以在缺乏结构特征和化学特征的脂肪酸长链上的特定位点进行脱饱和作用,有着非常强的底物选择性和特异性。其中 FADS6在脂质代谢中起着非常重要的作用,不仅能维持细胞内饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸平衡,也是许多代谢疾病和癌症的治疗靶点。FADS12 能将单不饱和脂肪酸油酸转化为 ω6 脂肪酸亚油酸,是脂肪酸脱饱和通路 ω6 途径和 ω3 途径的起点,而 FADS15 理论上可以催化所有的 ω6脂肪酸生成 ω3 脂肪酸,它们是脂肪酸合成通路中的关键酶。然而哺乳动物中的 FADS12 FADS15 基因在进化的过程中丢失,因此我们选择产油微生物模式菌株黑根霉中的 FADS12 FADS15 进行研究。黑根霉的总脂肪含量可以达到菌体生物量的 50%,它既可以通过 ω6 脂肪酸脱饱和途径产生 AA,又可以通过 ω3 脂肪酸脱饱和途径产生 EPA。因此,对黑根霉 FADS6FADS12 FADS15生化性质的研究不仅有助于脂肪酸脱饱和酶底物特异性和脱饱和机理的解析,更有助于有重要价值的 ω3 多不饱和脂肪酸的生产。

(二)项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。

.主要研究内容

(1) FADS6FADS12 FADS15 的表达和纯化

    首先构建含有 ZZ 标签和 RGS-10 His 标签和 HRV 3C 蛋白酶酶切位点的表达载体,使用毕赤酵母系统进行表达并筛选高表达量转化子。细胞破碎后,通过梯度离心分离膜组分,然后通过筛选最佳去垢剂将脂肪酸脱饱和酶从膜组分溶解,进而利用 IgG 亲和色谱、阳离子交换色谱和分子排阻色谱进行纯化。对 FADS6 融合细胞色素 b5功能域进行鉴定,并对 FADS12 FADS15 的铁活性中心进行研究。

(2)脂肪酸脱饱和酶体外反应体系的构建

    为了构建膜脂肪酸脱饱和酶体外反应电子传递链,使用大肠杆菌原核表达人源Cytb5Cytb5R CytP450R 可溶性功能域。并通过金属亲和色谱、阴离子交换色谱和分子排阻色谱法对目的蛋白质进行纯化。纯化的 Cytb5R 具有活性,可以还原 DCIP 底物,并且在 NADH 条件下能与纯化的 Cytb5 相互作用;纯化的 CytP450R NADPH 条件下也能与纯化的 Cytb5 相互作用。为脂肪酸脱饱和酶酶活测定的体外反应体系的建立奠定基础。

(3) FADS6FADS12 FADS15 底物选择性及酶动力学性质研究

   利用以 NADH 为还原力的脂肪酸脱饱和酶体外反应体系对 FADS12 FADS15 的底物选择性和酶动力学参数进行测定,同时对 NADPH 为还原力的反应体系的效率进行比较。对于含有融合 Cytb5 功能域的 FADS6,利用酿酒酵母破碎物系统对其活性和底物选择性进行测定。

(4)FADS12 FADS15 结构与功能关系分析

   根据已经解析的人和小鼠 FADS6 三维结构,通过初级序列比对、进化树分析和Poly Phobius 程序拓扑结构预测和蛋白质三维结构预测对 FADS12 FADS15 的穿膜 α-螺旋结构、双亲性 α-螺旋结构、活性中心位置和底物通道等结构特征进行预测分析,对结构与功能的关系进行分析。

.研究目标

(1)对黑根霉 FADS6FADS12 FADS15 进行异源表达和纯化,获取足量纯的活性蛋白质。表达和纯化脂肪酸脱饱和电子传递体细胞色素 b5Cytb5)、NADH-细胞色素 b5还原酶(Cytb5R)和 NADPH-细胞色素 P450 还原酶(CytP450R),构建体外脂肪酸脱饱和酶反应体系,测定脂肪酸脱饱和酶的底物选择性和催化特性。

(2)通过初级结构分析、拓扑结构预测和三维结构预测等对结构与功能关系进行解析。对黑根霉 FADS6FADS12 FADS15 底物选择性和催化特性的研究不仅有助于脂肪酸脱饱和机理、结构与功能关系的解析,更有助于有重要价值的多不饱和脂肪酸的生产。

.拟解决的关键科学问题

(1)FADS6FADS12 FADS15 的表达和纯化:构建含有 ZZ 标签和 RGS-10 His标签和 HRV 3C 蛋白酶酶切位点的表达载体,转化入毕赤酵母表达并对高表达量转化子进行筛选;通过膜组分分离和去垢剂筛选确定 Fos-Choline-16 为溶解膜组分、提取脂肪酸脱饱和酶的最佳去垢剂;进而利用 IgG 亲和色谱、阳离子交换色谱和分子排阻色谱进行纯化,获得均一的、纯的产物。

(2) 脂肪酸脱饱和酶体外反应体系的构建:构建含有 6 His 标签的细胞色素 b5NADH-细胞色素 b5还原酶和 NADPH-细胞色素 P450 还原酶表达载体,转入大肠杆菌进行表达;通过钴离子亲和层析、阴离子交换色谱和分子排阻色谱对蛋白质进行纯化;最终利用 2,6-二氯靛酚钠(DCIP)为底物测定 Cytb5R 的活性为 1072.0 U。在 NADH NADPH 条件下,细胞色素 b5还原酶和细胞色素 P450 还原酶可以分别与细胞色素 b5相互作用,细胞色素 b5被还原。

(3)FADS6FADS12 FADS15 底物选择性及酶动力学性质研究:利用以 NADH 为还原力的脂肪酸脱饱和酶体外反应体系对 FADS12 FADS15 的底物选择性和酶动力学参数进行测定,对于含有融合细胞色素 b5功能域的 FADS6,利用酿酒酵母破碎物系统对其活性和底物选择性进行测定。

(4) FADS12 FADS15 结构与功能关系分析:初级序列比对、进化树分析和PolyPhobius 程序拓扑结构预测和三维结构预测,为 FADS12 FADS15 对底物的选择性和在特定的位点进行脱饱和作用奠定结构基础。

(三)拟采取的研究方案及可行性分析。

.研究方法

1.脂肪酸脱饱和酶的表达和纯化

(1)脂肪酸脱饱和酶表达载体的构建

黑根霉 ATCC 32222 FADS6FADS12 FADS15 基因经密码子优化后,由Genscript 公司合成,并连接至表达载体 pPink-HC。目的基因表达单元 3’端连有 ZZ 蛋白质作为纯化标签,RGS-10 His 作为 Western Blotting 检测标签。

(2)毕赤酵母的转化和目的基因的诱导表达

(3 )SDS-PAGEWestern Blot分析

SDS-PAGE 按照《分子克隆实验指南(第三版)》所示方法进行,电泳前加入预染蛋白质 Marker,每个样品分别在两块蛋白胶中点样,一块用于 Western Blot,另一块染色观察电泳质量和各泳道点样蛋白总量。Western Blot 实验中 PVDF 膜的裁剪和激活,滤纸、凝胶和 PVDF 膜的叠放次序,转膜槽的使用等均按照《分子克隆实验指南(第三版)》进行。将转移槽置于冰上,转膜条件为 26 W 2 h。转膜后经 TBST 溶液漂洗后,使用 5%脱脂奶粉封闭,用 Anti-RGS-His10 HRP Conjugates 对目的蛋白质进行检测,用ECL 法显影,用 FluorChem FC3 成像仪观察。

(4 )HRV 3C蛋白酶表达载体的构建和在大肠杆菌中的表达

HRV3C 蛋白酶基因经密码子优化后,由 Genscript 公司合成,并连接至表达载体pET-15b,目的基因 N 端连有 6 个组氨酸作为纯化标签。大肠杆菌 BL21 的转化和转化子的筛选均按照《分子克隆实验指南(第三版)》所示方法进行。筛选的转化子接种于50 mL250 mL 摇瓶)含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基中,37℃、220 r/min 振荡培养15 h,使用此种子液按 1%的接种量接种于 1 L (2.8 L 摇瓶)含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基的中继续培养。当 OD600 到达 0.6~0.8 时,置于冰上冷却,加入 1 mM 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在 24℃诱导 4 h。收集的菌体于-80℃冻藏。

(5) HRV 3C蛋白酶的纯化将表达

HRV 3C 蛋白酶的菌体重悬于 150 mL 大肠杆菌破碎缓冲液。重悬后的细胞用 EmulsiFlex-C3 细胞破碎仪破碎,破碎压力为 20,000 psi。破碎液上清结合于 10 mL 钴离子柱子,然后用 3 倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤。目的蛋白质用 5~500 mM 浓度的咪唑19梯度洗脱。流出组分经 SDS-PAGE 分析后,选择合适的目的蛋白质组分,用 Vivaspin蛋白质浓缩管进行浓缩,液氮冻存。

(6)细胞膜组分的分离

(7)脂肪酸脱饱和酶的纯化

(8)蛋白质浓度和纯度的测定纯化

(9)脂肪酸脱饱和酶(FADS6)波长扫描和还原

(10)脂肪酸脱饱和酶(FADS12FADS15)的光谱吸收特征、消光系数及铁含量的测定

2.电子传递蛋白质表达载体的构建

人可溶性细胞色素 b5 NADPH-细胞色素 P450 还原酶基因由 Genscript 公司合成,密码子优化后连接至表达载体 pET-15b,目的基因 5’端连有 6 个组氨酸作为纯化标签。NADH-细胞色素 b5还原酶的表达载体为 Dr. Trepanier 赠与,表达载体为 pCRT7NT-TOPO,目的基因 5’端同样连有 6 个组氨酸作为纯化标签。

细胞色素P450还原酶的纯化

2 L7.5 gNADPH-细胞色素 P450 还原酶大肠杆菌菌体重悬于 35 mL 破碎缓冲液。重悬后的菌体置于冰上,用超声细胞破碎仪破碎,破碎功率小于 40 %1 min 内破碎 1.5 s 暂停 2 s 重复 8 次。破碎液 12,000 r/min 离心 25 min,取上清液备用。用 2 倍柱体积(40 mL)的平衡缓冲液平衡 10 mL 钴离子柱子,将细胞破碎上清液结合于填料。然后用 3 倍柱体积的无甘油洗涤缓冲液将 UV 检测器信号洗涤至基线。目的蛋白质用5~500 mM 浓度的咪唑梯度洗脱。通过蛋白质电泳鉴定出含有目的蛋白质的组分,用Vivaspin 浓缩管进行浓缩,液氮冻存。

3.脂肪酸脱饱和酶(FADS12FADS15)的活性测定

FADS12 FADS15 活性的测定通过与纯化的 Cytb5 Cytb5R 相互作用测定。在0.1 mL 反应体系中含有 20 mM HepespH 7.5, 150 mM NaCl, 1 μM NADH, 0.002%Fos-Choline 16, 不同底物浓度(0~300 μM)的脂肪酸辅酶 A 底物, 100 nM 脂肪酸脱饱和酶, 0.5 μM Cytb5 0.25 μM Cytb5R。反应在 96 孔板中进行,每个底物浓度 4 个平行。酶混合物和底物/NADH 混合物分别在不同孔中,28℃孵育 5 min。孵育完成后,用排枪将两种混合物混合,在 28℃下测定 422 nm 吸光值变化,记录 NADH 消耗时间,用于计算脱饱和酶活性。反应产物脂肪酸同时通过甲酯化和 GC-MS 检测验证,同时根据内标量对产物脂肪酸进行定量计算,对分光光度法进行校正。

4.脂肪酸脱饱和酶(FADS6)的活性测定

5.CytP450R依赖的脱饱和反应测定

.关键技术说明:

SDS-PAGEWestern Blot分析

    SDS-PAGE 按照《分子克隆实验指南(第三版)》所示方法进行,电泳前加入预染蛋白质 Marker,每个样品分别在两块蛋白胶中点样,一块用于 Western Blot,另一块染色观察电泳质量和各泳道点样蛋白总量。Western Blot 实验中 PVDF 膜的裁剪和激活,滤纸、凝胶和 PVDF 膜的叠放次序,转膜槽的使用等均按照《分子克隆实验指南(第三版)》进行。将转移槽置于冰上,转膜条件为 26 W 2 h。转膜后经 TBST 溶液漂洗后,使用 5%脱脂奶粉封闭,用 Anti-RGS-His10 HRP Conjugates 对目的蛋白质进行检测,用ECL 法显影,用 FluorChem FC3 成像仪观察。

HRV 3C蛋白酶表达载体的构建和在大肠杆菌中的表达

    HRV3C 蛋白酶基因经密码子优化后,由 Genscript 公司合成,并连接至表达载体pET-15b,目的基因 N 端连有 6 个组氨酸作为纯化标签。大肠杆菌 BL21 的转化和转化子的筛选均按照《分子克隆实验指南(第三版)》所示方法进行。筛选的转化子接种于50 mL250 mL 摇瓶)含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基中,37℃、220 r/min 振荡培养15 h,使用此种子液按 1%的接种量接种于 1 L (2.8 L 摇瓶)含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基的中继续培养。当 OD600 到达 0.6~0.8 时,置于冰上冷却,加入 1 mM 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在 24℃诱导 4 h。收集的菌体于-80℃冻藏。

HRV 3C蛋白酶的纯化将表达

    HRV 3C 蛋白酶的菌体重悬于 150 mL 大肠杆菌破碎缓冲液。重悬后的细胞用 EmulsiFlex-C3 细胞破碎仪破碎,破碎压力为 20,000 psi。破碎液上清结合于 10 mL 钴离子柱子,然后用 3 倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤。目的蛋白质用 5~500 mM 浓度的咪唑19梯度洗脱。流出组分经 SDS-PAGE 分析后,选择合适的目的蛋白质组分,用 Vivaspin蛋白质浓缩管进行浓缩,液氮冻存。

脂肪酸脱饱和酶(FADS12 FADS15)结构与功能关系分析

预测与分析方法

(1)脂肪酸脱饱和酶多序列比对和进化树的发生

蛋白质一级结构多序列的比对使用 EMBL-EBI 网站 Clustal Omega 程序进行。进化树的发生使用 MEGAver. 6软件进行。其中序列排列参数包括:Gonnet 得分矩阵,gap penalty 数值为 10gap extension penalty 数值为 0.1。进而使用系统发生模块的邻接(neighbor-joining)方法产生基于距离的系统发生树。系统发生中使用的参数包括:泊松模型(Poisson substitution model)和应对序列缺口的双向删除方法。

(2)脂肪酸脱饱和酶(FADS12FADS15)拓扑结构的模拟

黑根霉 FADS12 FADS15、小鼠 FADS6 和酵母脂肪酸 2-水解酶 Scs7p 拓扑结构的预测和模拟通过 PolyPhobius 程序进行。

(3)脂肪酸脱饱和酶(FADS12FADS15)三维结构的模拟

     黑根霉FADS12FADS15三维结构的预测通过I-TASSER在线服务器进行。生成的前五个最佳模型结合 PolyPhobius 拓扑结构预测结果进行筛选。三维构象、活性中心和底物结合位点的可视化和作图通过 PyMOL 软件进行。FADS12 FADS15蛋白质结构底物通道的预测通过 Discovery Studio 2017 R2 软件进行。

蛋白质纯化技术

   重组蛋白质的分离纯化可以根据蛋白质的特异性质,通过不同的色谱层析技术来实现。主要的纯化技术包括亲和纯化色谱、离子交换色谱、分子排阻色谱、疏水相互作用色谱和反向色谱法。亲和纯化色谱法主要利用重组蛋白质中标签的亲和作用进行纯化。常用的亲和标签包括组氨酸、谷胱苷肽 S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)等。其中利用组氨酸标签进行纯化的技术是利用组氨酸与过渡金属离子如 Ni2+Co2+的亲和作用,因此又叫做金属亲和纯化色谱(IMAC)。另外,也可以利用抗体与蛋白质的亲和作用,如蛋白质 A IgG 类型的抗体的亲和作用进行纯化。离子交换色谱主要根据蛋白质等电点 pI,通过调节缓冲液 pH 值,使蛋白质带上“表面静电荷”,根据目的蛋白质与杂蛋白质表面电荷的不同进行分离。根据蛋白质表面电荷的不同,可以分为阴离子交换色谱和阳离子交换色谱。根据柱子填料基质在不同 pH范围内离子化强度的高低,又可以分为强离子交换色谱和弱离子交换色谱。分子排阻色谱又称“分子筛”,原理是根据分子大小对不同组分进行分离,其中大分子量的组分优先流出,小分子量的分子最后流出。由于分子排阻色谱不受缓冲液组分、pH 等影响,有很广泛的应用。它可以用来分离单体和多聚体,测定蛋白质分子量等。

膜结合蛋白质、多蛋白质复合体分离纯化和包涵体的重新折叠是具有挑战性的。基因组测序发现有大概 30%的基因编码的都是膜蛋白质,并且它们组成超过 50%的药物靶点。尽管膜蛋白质非常重要,我们对膜蛋白质结构和功能的了解远远滞后于可溶性蛋白质。目前蛋白质结构数据库中只有约 1%的结构是膜蛋白质。膜结合蛋白质存在于膜脂质环境中,而现有的蛋白质色谱纯化技术均在水溶液环境中进行。为了让膜蛋白质能够分散在水环境中,通常使用去垢剂溶解膜组分,与膜蛋白质和脂质形成可溶性复合体。而去垢剂溶解是个对膜蛋白质的产量和活性不利的过程,蛋白质变性和多聚体时常会产生,因此去垢剂的筛选和溶解过程非常关键。

.技术路线(见下图)

4.可行性分析

本课题组前期在黑根霉 ATCC32222 脂肪酸脱饱和酶的异源表达系统的筛选上做了大量的工作,经过多次对大肠杆菌等原核表达系统和酿酒酵母等真核表达系统的尝试,最终筛选出毕赤酵母系统作为本课题中使用的膜蛋白质表达系统。FADS6 是将第一个碳碳双键引入脂肪酸长链的酶,在脂质代谢中起着非常重要的作用,不仅能维持细胞内饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸平衡,也是许多代谢疾病和癌症的治疗靶点。黑根霉 FADS6 是膜结合脂肪酸脱饱和酶,存在于内质网上。根据膜结合脂肪酸脱饱和酶是否含有融合细胞色素 b5Cytb5)功能域,可以分为亚铁血红素膜脂肪酸脱饱和酶(heme integral desaturase)和非亚铁血红素膜脂肪酸脱饱和酶(non-heme integral desaturase)。目前,哺乳动物人和小鼠中的 FADS6 被分离纯化,但二者都不含有 Cytb5 功能域。真核微生物中的 FADS6 属于亚铁血红素膜脂肪酸脱饱和酶。Mitchell 等对酿酒酵母中 FADS6 Cytb5 功能域的功能进行了体内实验研究,但并未对其进行分离纯化。因此,目前对于亚铁血红素脂肪酸脱饱和酶的成功分离纯化和体外性质研究国际上未有报道。而黑根霉 ATCC32222 FADS6 C 端含有Cytb5 功能域,属于亚铁血红素脂肪酸脱饱和酶。在课题组前期克隆、表达和纯化黑根霉 ATCC 32222 Δ6-I 脂肪酸脱饱和酶(以下简称 FADS6)的基础上,为保证 Cytb5 功能域的完整性,进一步构建含有高效纯化标签 ZZ-tag 的表达单元,采用IgG 亲和色谱纯化方法,分离和纯化含有完整 Cytb5 功能域的 FADS6,测定其底物选择性和对其 Cytb5 功能域进行鉴定。FADS12 FADS15 催化重要 ω6 和 ω3 多不饱和脂肪酸的产生,它们可以在缺乏结构特征和化学特征的脂肪酸长链上对特定位点进行脱饱和作用,有着非常强的底物选择性和特异性。然而哺乳动物中的 FADS12 FADS15 基因在进化的过程中丢失,因此我们选择产油微生物模式菌株黑根霉中的 FADS12 FADS15 进行研究。黑根霉的总脂肪含量可以达到菌体生物量的 50%,它既可以通过 ω6 脂肪酸脱饱和途径产生AA,又可以通过 ω3 脂肪酸脱饱和途径产生 EPA。因此,对黑根霉 FADS12FADS15 生化性质的研究不仅有助于脂肪酸脱饱和酶底物特异性和脱饱和机理的解析,更有助于有重要价值的 ω3 多不饱和脂肪酸的生产。

(四)本课题的特色与创新之处

特色:1.通过构建含有 RGS-10 His 标签和 ZZ 标签的表达载体,利用毕赤酵母真核表达系统,对 FADS6FADS12 FADS15 进行表达。进而筛选出了与脂肪酸长链有相似结构的去垢剂 Fos-Choline-16,实现了膜脂肪酸脱饱和酶的有效提取。通过 IgG 亲和色谱、阳离子交换色谱和分子排阻色谱纯化获得了均一的、纯的蛋白质。2. 对人源 Cytb5Cytb5R CytP450R 进行原核表达,通过钴离子亲和层析、阴离子交换色谱和分子排阻色谱纯化获得了活性蛋白质。3. 利用以 NADH 为还原力的脂肪酸脱饱和酶体外反应体系对 FADS12 FADS15的底物选择性和酶动力学参数进行测定。NADH 为还原力时脂肪酸脱饱和有更高的效率。4. 初级序列比对、进化树分析和 PolyPhobius 程序拓扑结构预测和三维结构预,为FADS12 FADS15 对底物的选择性和在特定的位点进行脱饱和作用奠定了结构基础。

    创新点:1.采用适合分离脂肪酸脱饱和酶的去垢剂 Fos-choline-16,纯化了具有活性的黑根霉 Δ6 脂肪酸脱饱和酶(FADS6)。2.纯化了黑根霉Δ12脂肪酸脱饱和酶(FADS12)和Δ15脂肪酸脱饱和酶(FADS15),并发现 FADS12 的偏好性底物为 18:1 (ω9)FADS15 的偏好性底物为 18:2 (ω6)

(五)年度研究计划及预期研究结果

1.年度研究计划

2.预期研究结果

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