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莲子心有效成分Nelumbonucifera effective components对人肠道菌群的影响及其机制研究
添加时间: 2019-4-15 14:41:26 来源: 作者: 点击数:

立题意义

    越来越多的科学实验表明,人体健康与肠道菌群息息相关。肠道细菌数量巨大,维持菌群组成平衡,对宿主健康具有重要意义。通常认为,功能性低聚糖可以促进肠道内双歧杆菌和乳杆菌的增殖,改善人体健康。然而,研究发现 BacteroidesClostridium 以及 Streptococcus 等肠道共生菌也具有利用低聚糖的能力,低聚糖也可能会对宿主产生副作用,如增加肠道通透性、Salmonella 异位、肠道不适等。由此可见,低聚糖与肠道菌群关系复杂,不仅仅局限于双歧效应,需要进一步深入研究能利用低聚糖的肠道细菌种类、低聚糖对菌群组成的影响,对于全面、客观理解低聚糖和肠道菌群的相互作用具有重要的意义。

主要研究内容

细菌利用低聚糖的研究主要采用纯培养的方法,通过测定细菌生长及低聚糖的含量来判断其是否具有利用低聚糖的能力。然而,肠道细菌数量庞大,而且大多数培养条件要求苛刻,无法通过纯培养法来研究其是否利用低聚糖。得益于基因组学和分子生物学技术的发展,人类微生物组计划 HMP 测定了大量的肠道细菌的全基因组(参考基因组),采用生物信息学分析的方法可以预测具有利用低聚糖潜力的肠道菌。随着高通量二代测序技术的进步,采用 16S rDNA 宏基因组测序的方法,可以全面研究低聚糖对肠道菌群组成的改变,不局限于特定种、属。具体研究内容如下:

1)利用低聚糖的肠道细菌的预测、分离与鉴定文献组学检索与低聚糖利用相关的转运蛋白和糖苷酶的基因,以 HMP 参考基因组为基础构建肠道细菌基因组的本地数据库,BLASTP 检索转运蛋白和糖苷酶的基因在肠道细菌中的分布;采用传统的培养法从健康成年人粪便中分离能利用低聚糖的细菌,并进行 16S rDNA 鉴定与表征。(2)采用 16S rDNA 宏基因组测序法分析低聚糖对小鼠粪便菌群的影响以 C57BL/6J 小鼠为实验对象,采用 Illumina 公司 MiSeq 测序仪对细菌 16S rDNAV4 区进行测序,初步研究低剂量和高剂量乳酮糖对小鼠粪便菌群组成的改变,细致研究低剂量、高剂量以及急性高剂量 FOS 对小鼠粪便菌群组成的影响。

3)低聚糖对小鼠肠腔内容物、粘膜菌群组成的影响及机制研究以 C57BL/6J 小鼠为实验对象,将结肠等分为近端、中端和远端,测定空白、低剂量和高剂量组小鼠盲肠、结肠各段内容物的 pH、短链脂肪酸、乳酮糖、铵含量等生化指标,并研究内容物和粘膜样品的菌群组成,二者结合探讨乳酮糖对小鼠肠腔内容物、粘膜菌群影响的机制。

4)细菌利用低聚糖与其在肠道内定植关系的研究以 SPF C57BL/6J 小鼠为实验对象,测定分离到的菌株在体外利用 FOS 生长的代时,采用 PCR 法测定 Escherichia coli CCFM8415Klebsiella sp. CCFM8375 Lactobacillus plantarum ST-III 在小鼠肠道内的定植情况,探讨细菌利用 FOS 能力与其在小鼠肠道内定植的关系。

实验设计

第一部分

利用低聚糖的肠道细菌的预测、分离与鉴定

    通常认为,低聚糖可以选择性地促进肠道内双歧杆菌、乳杆菌的增殖,抑制腐败菌的生长,对宿主发挥有益作用[36, 42, 94, 95]。然而,越来越多的体外实验研究表明,低聚糖除了可以被双歧杆菌、乳杆菌利用之外,Bacteroides fragilis[67, 68]Clostridium butyricum[67,68]Clostridium perfringens[66]Escherichia coli BEN2908[96]以及 Streptococcus faecalis[66]也可以利用低聚果糖、乳酮糖或者低聚阿拉伯糖,但是这些菌并非都是益生菌,甚至Escherichia coli BEN2908 还具有一定的致病性[96]。哪些种属的肠道细菌能够利用低聚糖,目前尚未有详细的报道。细菌利用低聚糖,通常需要转运蛋白和糖苷酶的共同参与,低聚糖水解成单糖后才能被细菌利用并为其提供能量。因此,转运蛋白和糖苷酶是决定细菌能否利用低聚糖的关键因素[97-99]。通常来讲,转运蛋白包括底物结合蛋白、透性酶和 ATP-结合蛋白,糖苷酶主要是胞内酶[63]。乳酮糖和低聚果糖是两种重要的功能性低聚糖,被公认为益生元[35]。乳酮糖结构简单,是由半乳糖和果糖通过 β-1,4-糖苷键连接成的二糖,自然界中不存在,通过酶法合成或者乳糖异构化得到,商品化的乳酮糖纯度高达 99%,自 20 世纪 50 年代以来就被认为是“双歧因子”[38];低聚果糖是研究最广泛的益生元,由 β-2,1-果糖苷键连接而成,纯度高达 95%以上,是一种重要的功能性食品配料。本章通过文献组学检索,得到与细菌利用低聚糖相关的转运蛋白、糖苷酶的基因,以人类微生物组计划 HMP 提供的参考基因组为基础构建肠道细菌本地数据库,BLASTP检索转运蛋白和糖苷酶的基因在肠道细菌中的分布,对其能否利用低聚糖进行预测,涉及到的低聚糖包括乳酮糖、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、棉籽糖和低聚阿拉伯糖;另外,采用传统的培养方法,从健康人的粪便中分离能利用乳酮糖、低聚果糖的细菌并进行鉴定,从而揭示能利用低聚糖的肠道细菌的种类。

1实验材料与设备

1.1试剂

    乳酮糖(HPLC 纯度 99.3%),美国 EMD Chemicals 公司;低聚果糖(GFn 型,MeioligoP),上海格信健康科技有限公司,主要组成为:6.5%蔗果六糖、43.4%蔗果五糖、40.9%蔗果四糖、7.1%蔗果三糖以及2.1%葡萄糖和果糖;酵母提取物(Oxoid)、胰蛋白胨(Oxoid)北京希凯创新科技有限公司;高铁血红素,Sigma 公司(美国);ATCC vitamin mixATCCtrace mineral mix,美国典型菌种保藏中心(ATCC);其余试剂均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;Taq DNA 聚合酶(Tiangen),上海科晴生物科技有限公司;引物合成及 16S rDNA 测序工作由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.2菌株

    Bifidobacterium dentium KCTC 3361Clostridium leptum KCTC 5155Enterococcussaccharolyticus KCTC 3643Mitsuokella multacida KCTC 5453Pediococcus acidilacticiKCTC 15064Clostridium nexile KCTC 5578Clostridium scindens KCTC 5591Ruminococcus gnavus KCTC 5920Weissella paramesenteroides KCTC 3531 购于韩国典型菌种保藏中心(KCTC);Megamonas funiformis JCM 14723 购于日本微生物保藏中心(JCM);Marvinbryantia formatexigens DSM 14469Ruminococcus obeum DSM 25238 购于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ);Bifidobacterium adolescentis CICC 6070 购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC);Clostridium perfringensATCC 13124 购于美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC);Lactobacillus acidophilus ATCC 4356Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842Lactobacillus fermentum ATCC 14931 以及Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ATCC 14917 由内蒙古农业大学张和平教授馈赠;Lactobacillus reuteri CCFM 8217Leuconostoc mesenteroides CCFM 8220 由江南大学食品微生物菌种保藏中心提供。

2.2.3培养基

分离、培养肠道细菌的培养基,参照 Goodman 等人[100]的配方并有所改进(GMM),配方:4 g 乳酮糖(或低聚果糖)、2 g 胰蛋白胨、1 g 酵母提取物、2 g KH2PO40.002 gMgSO4·7H2O0.08 g NaCl8 mg CaCl20.73 mg FeSO4·7H2O1.2 mg 高铁血红素、10mL ATCC vitamin mix10 mL ATCC trace mineral0.5 mL 吐温-800.5 g L-半胱氨酸盐酸盐,加水至 1000 mL,调节 pH 7.0±0.1115℃灭菌 20 min。其中,乳酮糖、低聚果糖经 0.22 μm 滤膜过滤除菌后添加到培养基中。分离细菌时,添加质量浓度为 0.5%的溴甲酚紫溶液做指示剂,添加量为 15 mL/L。脑心浸液培养基(BHI),购于美国 Sigma 公司。

2.2.4主要仪器和设备

电子天平、pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;高压蒸汽灭菌锅MLS-3750,日本 Sanyo 公司;冷冻高速离心机,德国 Eppendorf 公司;厌氧工作站 Whitley DG250,英国 DWS 公司;Bio-Rad T100 PCR 仪、核酸电泳仪、凝胶成像仪,美国 Bio-Rad 公司;紫外可见分光光度计 UV1800,日本岛津公司;高效液相色谱仪 Waters 600,美国 Waters公司。

实验方法

1肠道细菌本地数据库的建立

    根据人类微生物组计划(HMP)提供的参考基因组,得到 382 个肠道细菌的 proteinmultifastaPEPhttp://hmpdacc.org/HMRGD/),采用 customized script 去冗余;对比 HMPsmothur community profiling 得到的 16S rDNA 宏基因组的序列数据(http://hmpdacc.org/HMMCP/),mothur community 输出结果中有 107 个属未出现在参考基因组中。因此,从 National Center for Biotechnology InformationNCBI)数据库检索这 107 个属对应的细菌的基因组,并下载到 98 个,合并到肠道 PEP 文件中,然后按照 BLAST 数据库的格式进行标准化。由此构建的本地数据库,总有 453 株肠道细菌。

2转运蛋白和糖苷酶基因的检索

     经文献检索,共获得 41 个与低聚半乳糖利用相关的基因,其中 22 个与低聚半乳糖的转运有关,19 个与低聚半乳糖糖苷键的水解有关(表 2-1)。

     文献检索发现,与乳酮糖利用相关的基因,目前还没有报道(截止到 2015 2 月)。同低聚半乳糖的糖苷键连接类似,乳酮糖也是 β-1,4-糖苷键连接,且都含有半乳糖结构。因此,可以检索与低聚半乳糖利用相关的基因来预测具有利用乳酮糖能力的肠道细菌。

    经文献检索,共获得 32 个与低聚果糖利用相关的基因,其中 23 个与低聚果糖的转运有关,9 个与低聚果糖糖苷键的水解有关(表 2-2)。

    经文献检索,共获得 20 个与低聚异麦芽糖利用相关的基因,其中 11 个与低聚异麦芽糖的转运有关,9 个与低聚异麦芽糖糖苷键的水解有关(表 2-3)。

    经文献检索,共获得 38 个与棉籽糖利用相关的基因,其中 18 个与棉籽糖的转运有关,20 个与棉籽糖糖苷键的水解有关(表 2-4)。

    经过文献检索,共获得 25 个与低聚阿拉伯糖利用相关的基因,其中 9 个与低聚阿拉伯糖的转运有关,16 个与低聚阿拉伯糖糖苷键的水解有关(表 2-5)。

3 BLASTP检索

    以构建的肠道细菌本地蛋白库为数据库来源,与低聚糖利用相关的转运蛋白和糖苷酶作为检索条件进行 BLASTP 检索,如果比对长度超过转运蛋白(或者糖苷酶)序列长度的 70%,匹配度 identity大于 40%,则认为该菌株具有对应的转运蛋白(或者糖苷酶)的同源蛋白。

4利用乳酮糖、低聚果糖的肠道细菌的分离与鉴定

    采集 5 名健康成年人(25~29 岁)的粪便样品,按照 15 mL/g 粪便的比例添加 0.1 MPBS 缓冲液(80 g NaCl2 g KCl14.4 g Na2HPO42.4 g KH2PO40.5 g L-Cys-HCl,加水至 1000 mLpH 7.0),置于漩涡振荡器分散均匀,用 0.1 M PBS 缓冲液梯度稀释,取 0.1 mL 稀释度为 10-310-410-5的样品涂布在已添加溴甲酚紫指示剂的 GMM 平板(乳酮糖或低聚果糖作唯一碳源)上,置于厌氧工作站(80% N210% CO210% H2)中,37℃培养 24~48 h。挑取周围变黄的菌落,转接到 GMM 液体培养基中,经厌氧培养并划线分离、纯化。纯化后的菌株,点接种到添加溴甲酚紫的 GMM 平板上,如果菌落周围培养基颜色变为黄色,则证明该菌能利用乳酮糖(或低聚果糖)。

5细菌利用乳酮糖、低聚果糖生长的表征

    利用乳酮糖的细菌接种到 GMM 液体培养基(乳酮糖作唯一碳源)中,置于 37℃培养 24 h,每 2 h 取样测定菌液在 600 nm 吸光度(OD600),测定上清液 pH 及乳酮糖含量。第二章 利用低聚糖的肠道细菌的预测、分离与鉴定15利用 FOS 的细菌接种到 BHI 液体培养基(FOS 作唯一碳源,浓度为 4 g/L)中,置于 37℃培养 24 h,每 2 h 取样测定菌液在 600 nm 波长的吸光度(OD600),并测定上清液的 pH FOS 含量。

6乳酮糖、低聚果糖含量的测定

    上清液中乳酮糖含量的测定,参照 Zhang 等人[43]的方法,具体如下:试管中加入 1mL 上清液,然后加入 2.8 mL 75%浓硫酸(v/v),置于 46℃水浴锅中反应 70 min;反应结束,加入 0.2 mL 显色剂(0.08%色氨酸+2.5%半胱氨酸盐酸盐),测定 518 nm 处的吸光值。上清液中 FOS 含量的测定,采用 HPLC 法,外标法定量,色谱条件如下:分离采用色谱柱 Waters SugarPak16.5×300 mm,内径 3.5 μm),柱温 85℃,流动相为水,流速为 0.4 mL/min,采用示差折光检测器。

7细菌基因组DNA提取取

    1.0 mL 对数生长末期的细菌菌液,13,000 g 离心 1 min 收集菌体,加入 500 μLTE缓冲液(10 mM Tris-HCl1 mM EDTApH 8.0)重悬菌体,然后加入 20 μL 20 mg/mL的溶菌酶,37℃水浴 1 h;取出,加入 20 μL 10%SDS 溶液以及 5 μL 20 mg/mL 的蛋白酶K,混匀,置于55℃水浴至澄清;取出,加入550 μL饱和酚/氯仿/异戊醇溶液(25:24:1),轻轻颠倒混匀,13,000 g 离心 10 min;取上清,加入 500 μL 预冷的无水乙醇,轻轻颠倒混匀,置于-20℃冰箱 40 min;取出后 13,000 g 离心 15 min,弃上清,得 DNA 沉淀,加入 500 μL 70%乙醇,重悬 DNA13,000 g 离心 10 min,弃上清,室温干燥 DNA;加入60 μLTE 缓冲液溶解 DNA,保存于-20℃。

8细菌16S rDNA鉴定

    以提取的细菌基因组 DNA 为模板,采用通用引物 27F5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’)和 1492R5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’),PCR 扩增 16S rDNA 片段(1500 bp 左右),反应体系(50 μL)如下:模板 1 μL上游引物 27F20 μM0.5 μL下游引物 1492R20 μM0.5 μLTaq 0.5 μLTaq buffer 5 μLdNTP 5 μL双蒸水 37.5 μLPCR 反应条件如下:955 min9530 s5030 s721 min 30 s30 个循环;7210 min1210 minPCR 反应结束,进行 1.0%琼脂糖凝胶电泳,电压 120 V,约 40 min,凝胶成像仪拍照并记录电泳结果;PCR 产物由生工生物工程(上海)有限公司完成测序;序列完成拼接并在 NCBI 数据库中进行 BLAST 比对,确定待测细菌的种属。

9数据统计与分析

    不同组(>3)之间的显著性差异通过进行 ANOVA 进行判断(Tukeys 检验),两组之间的显著性差异通过 t 检验进行判断(SPSS 16.0 软件),P < 0.05 则认为差异显著。

第二部分 低聚糖对小鼠粪便菌群组成的影响

肠道菌群复杂多样,维持菌群平衡对于人体健康具有重要的意义。肠道菌群平衡被破坏,可能会诱发肥胖[168]、糖尿病[21]以及炎症[169]等疾病。饮食是影响肠道菌群的一个重要因素[170],尤其是其中的不消化糖类,可以到达大肠改变其菌群组成。通常认为,低聚糖会选择性地促进肠道内有益菌的增殖,从而对宿主健康具有促进作用。然而,也有报道称 FOS 会增加大鼠肠道的通透性[77],在高剂量时甚至会增加Salmonella 的异位[80],过量食用低聚糖也会引起肠道不适[82-84],如腹鸣、胀气。另外,已经通过实验证实,肠道内多种菌都能利用乳酮糖、FOS 或者其他低聚糖,在肠道内低聚糖如何影响这些菌,尚未研究清楚。由此可见,低聚糖对肠道菌群的影响非常复杂,而之前的研究主要集中于特定的种属(如双歧杆菌、乳杆菌、梭状芽孢杆菌)[167],缺乏全面的研究。得益于高通量二代测序技术的发展,16S rDNA 宏基因组分析用于研究菌群组成的变化,可以覆盖肠道内的所有属。

本章主要采用 16S rDNA 宏基因组测序技术分析不同剂量的乳酮糖、FOS 对小鼠粪便菌群组成的影响,并细致考察低剂量、梯度剂量、急性高剂量 FOS 对菌群组成的改变,对于研究低聚糖和肠道菌群的关系具有一定的指导意义。

实验材料与设备

1试剂

    乳酮糖(HPLC 纯度 99.3%),美国 EMD Chemicals 公司;低聚果糖(GFn 型,MeioligoP),上海格信健康科技有限公司;戊巴比妥钠,美国 Sigma 公司;脑心浸液培养基(BHIOxoid),美国 Sigma 公司;Taq DNA 聚合酶,上海科晴生物科技有限公司;细菌基因组提取试剂盒 FastDNASpin Kit for Soil,北京联立信生物技术有限公司;胶回收试剂盒GeneClean Turbo,安倍医疗器械贸易(上海)有限公司;Quant-iT PicoGreen dsDNAAssayKit,美国 Life Technologies 公司;KAPABiosystems Library Quantification Kit,美国 KAPABiosystems公司;TruSeq DNALT Sample Preparation KitMiSeq Reagent Kit,美国Illumina公司。

2实验动物

   SPF 6 周龄 C57BL/6J 雄性小鼠,购于上海实验动物中心。

3主要仪器和设备

    快速核酸提取仪 FastPrep-24,美国 MP 公司;SpectraMax M5 酶标仪,美国 MolecularDevices 公司;Agilent Bioanalyzer 2100,美国安捷伦公司;MiSeq 测序仪,美国 Illumina公司;CFX Connect Real-time System,美国 Bio-Rad 公司;超低温冰箱,美国 Thermo第三章 低聚糖对小鼠粪便菌群组成的影响27Scientific 公司;其余仪器设备同

实验方法

1乳酮糖干预的动物实验设计

将小鼠随机分配到空白、低剂量、高剂量三个组中(5 /组,平均体重为 20.2 ± 1.1g),饲喂于独立通风笼(IVC)系统(江南大学实验动物中心),严格控制 12 h 光照/黑夜,环境温度设定在 22℃;小鼠自由进食、进水。本动物实验中所用的所有方法均经过江南大学伦理委员会审阅并批准(JN No. 20140306-0910-7),并符合欧盟实验动物指南(Directive 2010/63/EU)。图 3-1 乳酮糖对小鼠肠道菌群影响的实验设计Fig. 3-1 Experimental design for the effects of lactulose on the intestinal microbiota in mice本实验共分为 3 周,第 1 周为适应期,第 23 周为乳酮糖干预期(图 3-1)。商品化小鼠饲料经粉碎后,按照一定的比例添加乳酮糖(0%5%15%),并挤压成球形;在适应期,3 组小鼠均进食空白饲料;在干预期,空白组小鼠进食空白饲料(乳酮糖 0%),低剂量组和高剂量组小鼠分别进食 5%15%的乳酮糖饲料,每天记录小鼠的进食量,计算乳酮糖的摄入量。第 1 周和第 3 周收集小鼠粪便样品:将单只小鼠转移至独立的已灭菌的鼠笼,采集新鲜粪便,置于冰上,2 h 内带回实验室,保存于-80℃。实验结束,腹腔注射戊巴比妥钠溶液(200 mg/kg)使小鼠安乐死。

2低聚果糖干预的动物实验设计

将小鼠随机分配到空白、低剂量、高剂量、急性四个组中(8 /组,平均体重为19.2 ± 1.3 g),饲喂于独立通风笼(IVC)系统(江南大学实验动物中心),严格控制 12h 光照/黑夜,环境温度设定在 22℃;小鼠自由进食、进水。本动物实验中所用的所有方法均经过江南大学伦理委员会审阅并批准(JN No. 20140306-0910-7),并符合欧盟实验动物指南(Directive 2010/63/EU)。本实验共分为 6 周,第 1 周为适应期,第 234 周为 FOS 干预期,第 56 周为恢复期(图 3-2)。商品化的小鼠饲料经粉碎后,按照一定的比例添加 FOS0%5%15%25%),并挤压成球形。在适应期,四组小鼠均进食空白饲料;在干预期,低剂量组小鼠进食 5%的低聚果糖饲料,高剂量组小鼠进食 5%15%25%FOS 饲料各 1周,急性高剂量组小鼠进食 25%的低聚果糖饲料 2 天;恢复期,四组小鼠进食空白饲料。在干预期,每天记录小鼠进食量,计算 FOS 的摄入量;小鼠每周称重。按照图 3-2 所示的时间点收集小鼠粪便样品。实验结束,腹腔注射戊巴比妥钠溶液(200 mg/kg)使小鼠安乐死。图 3-2 低聚果糖对小鼠肠道菌群影响的实验设计Fig. 3-2 Experimental design for the effects of FOS on the intestinal microbiota in mice饲料中 FOS 的添加比例,根据预实验的结果确定:24 C57BL/6J 小鼠随机分为 6组,饲喂 FOS 饲料,添加比例分别为 2%5%10%20%25%30%,每天记录小鼠的进食量,对应的 FOS 摄入量分别为 0.1 g0.2 g0.4 g0.6 g0.8 g 1.0 g。通过观察小鼠粪便状态,发现 1 25%组小鼠和 4 30%组小鼠在进食 1 周后出现轻微腹泻现象,粪便松弛、不成形、含水较多。因此,实验设计时,饲料中 FOS 的添加量定为5%(低剂量)和 25%(高剂量)。小鼠粪便收集后,采用 16S rDNA 宏基因组的方法分析小鼠粪便中的细菌组成。

3细菌基因组的提取

根据 Hanski 等人的研究[171],按照 FastDNASpin Kit for Soil 试剂盒的说明书提取小鼠粪便中的细菌基因组,具体操作方法如下:(1)称量约 0.1 g 的小鼠粪便样品,置于 Lysing Matrix E 管中,加入 978 μL SodiumPhosphate Buffer 122 μL MT Buffer,室温静置 30 min 使样品松散;将 Lysing Matrix E管放置到 FastPrep 快速核酸提取仪上,破碎样品,转速 6 m/s,时间 20 s,共两次;(2)破碎完成后,14,000 g 离心 30 s;(3)转移上清至干净的 1.5 mL EP 管中,加入 250 μL PPS 溶液,颠倒混匀 10第三章 低聚糖对小鼠粪便菌群组成的影响29次,14,000 g 离心 5 min;(4)转移上清至干净的 15 mL 离心管中,重悬 Binding Matrix Suspension,取 1 mL加入到上清中,轻轻颠倒混匀 2 min 使 DNA 结合到 Matrix 上;室温静置 3 min,使 Matrix沉降;(5)小心去除500 μL上清,避免接触到Binding Matrix;重悬剩余的Binding Matrix,转移 600 μL SPINTMFilter 中,14,000 g 离心 1 min;弃接收管中滤液,将剩余的 BindingMatrix 加入到 SPINTMFilter 中,14,000 g 离心 1 min,弃接收管中滤液;(6)加 500 μL 稀释好的 SEWS-M 溶液至 SPINTMFilter 中,14,000 g 离心 1 min,弃接收管中滤液;14,000 g 离心 2 min 以去除残留的 SEWS-M 溶液;(7)将 SPINTMFilter 取出放置到新的接收管中,室温干燥 5 min;(8)加入 50 μL DES 溶液,14,000 g 离心 1 min,得基因组 DNA,保存于-20℃。

4细菌16S rDNAV4PCR扩增

以细菌基因组为模板,扩增 16S rDNA V4 区(200 bp 左右,上游引物 520F5-AYTGGGYDTAAAGNG-3’;下游引物 802R5-TACNVGGGTATCTAATCC-3’),不同样品用 7 个碱基组成的 barcode 进行区分,加在上游引物 520F 5’端[172]50 μL 的反应体系为:模板 1 μL上游引物 520F20 μM0.5 μL下游引物 802R20 μM0.5 μLTaq 0.5 μLTaq buffer 5 μLdNTP 5 μL双蒸水 37.5 μLPCR 反应条件为:955 min9530 s5030 s7230 s30 个循环;7210 minPCR 反应结束,进行 1.0%琼脂糖凝胶电泳,电压 120 V,约 60 min,凝胶成像仪拍照并记录电泳结果。

5 V4PCR产物的胶回收与定量

根据电泳结果,切胶(250 bp 左右),按照 GeneClean Turbo 试剂盒的说明书回收PCR 产物,具体操作方法如下:(1)切胶后,称重,置于 1.5 mL EP 管中;(2)按照 100 μL/0.1 g 的比例加入 Salt Solution55℃溶胶 5 min,吹打均匀;(3)转移 DNA-Salt Solution Cartridge 中(<600 μL),13,000 g 离心 30 s,弃下层滤液;(4)加 500 μL Wash Solution Cartridge 的滤膜上,13,000 g 离心 30 s,弃下层滤液;(513,000 g 离心 4 min 以去除残留的 Wash Solution

6)更换新的接收管,加入 30 μL Elution Solution,室温静置 5 min13,000 g离心 1 min,得 DNA,保存于-20℃冰箱。回收后的 PCR 产物,按照 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 试剂盒的说明书测定其浓度(ng/μL)。

6混样、文库构建以及上机测序

根据 PicoGreen 荧光染料的定量结果,按等质量浓度混合样品,总体积为 50 μL,样品总量>100 ng,样品数量<50。按照 TurSeq DNALT Sample Preparation Kit 试剂盒说明书构建文库,主要包括末端修复、3’端加 A、接头连接以及 PCR 扩增等步骤。文库构建完成后,采用 Agilent Bioanalyzer 2100 测定 DNA 片段大小;qPCR 法精确测定 DNA 的浓度(ng/μL),按照 KAPA Biosystems Library Quantification Kit 试剂盒的说明书进行;计算文库的摩尔浓度(nM):A*106/(650*B),其中 A 代表质量浓度(ng/μL),B 代表片段大小,650 为每个 bp 的平均分子量。将构建的文库分别稀释至 2 nM,根据数据量要求按比例混样;将 2 N NaOH 溶液稀释至 0.1 N,取 10 μL 10 μL 混合文库,室温(25℃)变性 5 min(严格计时);加入 980 μL 预冷的 HT1(上机试剂盒中试剂,此时样品浓度为 20 pM)终止反应;取500 μL 500 μL HT1 混合(此时样品浓度为 10 pM);取 1 mL 加入到已融化的上机试剂盒 Reagent Kit Cartridge 中,MiSeq 测序仪上机测序。

7下机数据处理

测序完成后,按照以下标准筛选原始序列:质量得分>30;不含有歧义碱基;均聚物检测<6;引物无错配;序列长度大于 200 bp。去除引物序列,舍弃不能拼接的单端序列,按照重叠碱基>10 bp 且无错配的标准拼接序列。拼接得到的高质量序列,以 97%相似度为阈值进行 ulust 聚类,建立操作分类单元(Operational Taxonomic UnitOTU),通过 Ribosomal Database Project (RDP) Naive Bayesclassifier[173]鉴定 OUT 种系型。在 QIIME[174]平台中用 PyNAST aligner[175]将序列与 greengenes core set 进行比对,利用 FastTree[176]生成系统发育进化树;绘制稀释曲线,计算样品的 α-多样性、β-多样性,主要用超 1 指数(Chao1 estimator)和香农指数(Shannon index)用来评估样品的菌群多样性;基于 UniFrac 距离[177]对样品进行加权(weighted)和非加权(unweighted)的主坐标分析(Pricipal CoordinatesAnalysis, PCoA),对样品进行聚类。实验中所涉及的序列数据已提交至 Rapid Annotation using Subsystems Technologyfor Metagenomes databaseMG-RAST)数据库,登录号为 4578758.3-4578850.3

8 Olsenella的分离与鉴定

3 C57BL/6J 小鼠喂食 25%FOS 饲料 1 周后,将小鼠分别转移到已灭菌的独立笼子中,分别采集粪便,立即加入到含有 0.9%生理盐水的 5 mL EP 管中;梯度稀释,取 10-510-610-7三个稀释度的样品分别涂布到添加 FOS BHI 固体培养基(8 g/L)上,置于厌氧工作站中,37℃培养 48 h;挑取菌落,进行革兰氏染色和 16S rDNA 鉴定,按照第二章 2.3.72.3.8 所述的方法进行实验。经 16S rDNA 鉴定为 Olsenella 属的菌株,用 60%的甘油保存于-80℃冰箱。

9 Olsenella

利用低聚果糖生长的表征分离到的 Olsenella 菌株,分别接种到 BHI BHI-FOS 液体培养基中,37℃厌氧培养 24 h,每 2 h 取样测定 OD600;菌液经 13,000 g 离心 2 min 后所得上清液,采用 HPLC法测定其 FOS 的含量,方法参照第二章 2.3.6

10数据统计与分析

不同组(>3)之间的显著性差异通过进行 ANOVA 进行判断(Tukeys 检验),两组之间的显著性差异通过 t 检验进行判断(SPSS 16.0 软件),P < 0.05 则认为差异显著。

第三部分 低聚糖对小鼠肠腔内容物和粘膜菌群组成的影响

人体肠道细菌,在很长一段时间内保持种属稳定[22],但菌群中各种菌的相对丰度是高度可变的[23],受环境影响很大[182]。由于样品容易获得,以往肠道菌群的研究主要集中于粪便样品[6, 170, 183],关于肠腔内容物、粘膜菌群的研究则相对较少。在结肠,上皮细胞外覆盖着两层粘膜,外层粘膜较松散,定植着大量的共生细菌[184, 185],作为肠道防御的第一道屏障,在宿主-细菌相互作用中发挥着重要的作用。粪便样品的菌群组成与肠腔内容物、粘膜菌群存在差异[87, 186],研究内容物、粘膜菌群的空间差异、分布,对于深入理解肠道菌群和疾病的相互作用、关系[8],具有重要的指导意义。实验发现,小鼠摄入高剂量低聚糖时,其粪便菌群组成会发生显著改变,但具体作用机制尚未阐明,需要进一步分析低聚糖在盲肠、结肠内与菌群的相互作用。自 20 世纪 50 年代以来,乳酮糖就被认为是一种“双歧因子”,对健康发挥有益的作用[38]。乳酮糖是结构明确的二糖,纯度达到 99.3%,而 FOS 是多个聚合度的混合物;肠腔内容物样品成分复杂,测定 FOS 时干扰较多,而乳酮糖测定可采用比色法[43],葡萄糖的干扰可以通过葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖的量来排除。C57BL/6J 小鼠是肠道微生物研究中常用的实验动物,Gu 等人已经报道了胃、小肠、盲肠、结肠内容物的菌群组成[187],但并未研究粘膜菌群,盲肠、结肠的生理条件(如pH、短链脂肪酸、铵)也尚未有人报道。因此,为了便于检测内容物中的低聚糖,本实验选取乳酮糖作为低聚糖的代表,研究不同剂量的乳酮糖对 C57BL/6J 小鼠的盲肠与结肠的内容物、粘膜菌群组成的影响,揭示低聚糖和肠道微生物的相互作用机制。

实验材料与设备

1试剂

乳酮糖(HPLC 纯度 99.3%),美国 EMD Chemicals 公司;AIN-93-VX Vitamin MixAIN-93G Mineral Mix,美国 MP 公司;面粉,潍坊风筝面粉有限责任公司;大豆油,益海嘉里投资有限公司;椰子油,上海磐臣贸易有限公司;异戊酸,生工生物工程(上海)股份有限公司;苯酚、亚硝基铁氰化钠、NaOHNaClO,分析纯,国药集团化学试剂有限公司;其余试剂均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司;葡萄糖测定试剂盒,上海荣盛生物药业有限公司;Taq DNA 聚合酶(Tiangen),上海科晴生物科技有限公司;其余试剂同第三章 3.2.1

2培养基

GMM 培养基配制同第二章 2.2.3

3实验动物

清洁级 6 周龄 C57BL/6J 雄性小鼠,购于上海实验动物中心。

4主要仪器和设备

电子天平、pH 计、InLab Solids pH 电极,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;气相色谱质谱联用仪 GCMS-QP2010 Ulra System,日本岛津公司;全自动生化分析仪BS-480,深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;其余仪器设备同

第三章 3.2.3

实验方法

1实验设计

将小鼠随机分配到空白、低剂量、高剂量三个组中(8 /组),饲喂于独立通风笼(IVC)系统(江南大学实验动物中心),严格控制12 h光照/黑夜,环境温度设定在22℃;小鼠自由进食、进水,各组饲料配方见表 4-1,参照 Campbell 等人[188]提出的配方并进行调整。本动物实验中所用的所有方法均经过江南大学伦理委员会审阅并批准(JN No.20140926-1226-35),并符合欧盟实验动物指南(Directive 2010/63/EU)。表 4-1 各组饲料配方Table 4-1 Ingredient composition of diets for different groups配方 空白 低剂量(乳酮糖, 5%) 高剂量(乳酮糖, 15%100 g 干物质Casein hydrolysate 19.7 19.7 19.7L-Cystine 0.3 0.3 0.3面粉 30 30 30葡萄糖 34.75 29.75 19.75乳酮糖 0 5 15椰子油 7.88 7.88 7.88大豆油 2.62 2.62 2.62Choline bitartrate 0.25 0.25 0.25Vitamin mix 1 1 1Mineral mix 3.5 3.5 3.5本实验分 3 周,第 1 周为适应期,第 23 周为乳酮糖干预期(图 4-1)。在经过 1周的适应期后,处死 3 只小鼠,收集盲肠、结肠的内容物和粘膜样品,用于分离利用乳酮糖的细菌。在适应期,三组小鼠均进食空白饲料,每天记录小鼠的体重、进食量,同时观察小鼠粪便形态;在干预期,空白组小鼠进食空白饲料,低剂量组和高剂量组小鼠分别进食5%15%的乳酮糖饲料,每天记录小鼠的体重、进食量;干预期结束,摘眼球采血,脱臼法处死小鼠,收集盲肠、结肠的内容物和粘膜样品,分析其质量、pH、短链脂肪酸以及细菌菌群组成等。血液收集后分离血清,采用全自动生化分析仪测血清中各项生化指标。

2盲肠、结肠的总重和壁重

小鼠处死后,立即摘取盲肠、结肠,分别称重,记为总重;收集内容物后,盲肠、结肠分别称重,记为壁重。按照 Gustafsson 等人[189]的方法收集粘膜样品,将内容物和粘膜保存于-80℃冰箱。将结肠等分为三段,按照距离盲肠的远近分别称为近端、中端和远端。

3内容物pH的测定

称取一定质量的内容物,按照 15 mL/g 添加去离子水[190],充分分散,13,000 g 离心2 min,用 InLab Solids pH 电极测定上清的 pH

4内容物中SCFAs含量的测定

称取 20 mg 盲肠、结肠内容物,用 500 μL 饱和 NaCl 溶液重悬,加入 20 μL 10%H2SO4酸化;加入 800 μL 乙醚,振荡混匀,提取脂肪酸,然后 18,000 g 离心 15 min;取上层乙醚相,加入 0.25 g 无水 Na2SO4进行干燥;静置 30 min 后,18,000 g 离心 5 min,取上层乙醚相,用 GC-MS 分析其短链脂肪酸(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和异戊酸)的含量。

GC-MS 采用 Rtx-Wax 柱,柱长 30 m,内径 0.25 μm;载气为 He,流速为 2 mL/min;进样体积为 1 μL,分流比为 10:1;进样温度设定为 240℃,按如下程序进行升温:起始温度为 100℃,按 7.5/min 升温至 140℃,然后按 60/min 升温至 200℃,保持 3 min,离子化温度为 220℃;分析采用全扫描模式,外标法计算各短链脂肪酸的浓度(μmol/g)。

5内容物中铵含量的测定

用去离子水重悬内容物样品(20 mg/mL),充分振荡、混匀,18,000 g 离心 15 min,取上清,按照 Chaney 等人[191]的方法测定铵的浓度,流程如下:配制溶液 110 g/L 苯酚、0.05 g/L 亚硝基铁氰化钠)和溶液 25 g/L NaOH0.42 g/L NaClO),向 1 mL 样品中连续加入 5 mL 溶液 1 5 mL 溶液 2,振荡、混匀,室温反应 45 min,测定 635 nm处的吸光值。

6内容物中乳酮糖、葡萄糖含量的测定

按照 Dotz 等人[192]的方法提取内容物样品的乳酮糖、葡萄糖,流程如下:样品融化后,添加去离子水使样品分散(0.02 g/mL),20℃轻轻振荡 1.5 h18,000 g 离心 10 min;取上清,测定乳酮糖、葡萄糖的含量。乳酮糖含量的测定,按第二章 2.3.6 描述的方法进行;葡萄糖含量的测定,按照葡萄糖测定试剂盒的说明书进行。

7血清代谢参数测定

小鼠眼球取血后,室温静置 3 h3,000 rpm 离心 15 min,分离上层血清,保存于-80℃。血清中生化指标,采用全自动生化分析仪测定,包括葡萄糖、总胆固醇 TC、甘油三酯 TG、低密度脂蛋白胆固醇 C-LDL、高密度脂蛋白胆固醇 C-HDLIgAIgM IgG

8内容物和粘膜样品的16S rDNA宏基因组测序

分析样品中细菌基因组的提取,按照 FastDNASpin Kit for Soil 试剂盒的说明书进行,具体参照第三章 3.3.3,提取的基因组保存于-20℃。细菌 16S rDNA V4 PCR 扩增、胶回收与定量,按照第三章 3.3.43.3.5 描述的方法进行实验;混样、文库构建与上机测序,按照第三章 3.3.6 描述的方法进行实验;下机数据处理,按照第三章 3.3.7 描述的方法进行;实验中所涉及的序列数据已提交至GenBank 数据库,登录号为 SRP055016

9利用乳酮糖的细菌的分离、鉴定

称取一定量的内容物、粘膜样品,用灭菌的 0.9%生理盐水重悬,梯度稀释,涂布在以乳酮糖作唯一碳源的 GMM(溴甲酚紫作 pH 指示剂)平板上,37℃厌氧培养 24 h。挑取周围变黄的菌落,转接到 GMM 液体培养基中,划线分离、纯化,点接种到添加溴甲酚紫的 GMM 平板上,菌落周围培养基颜色变为黄色,则证明该菌能利用乳酮糖。对利用乳酮糖的菌株进行 16S rDNA 鉴定,按照第二章 2.3.7 2.3.8 所描述的方法进行实验。

10数据统计与分析

不同组(>3)之间的显著性差异通过进行 ANOVA 进行判断(Tukeys 检验),两组之间的显著性差异通过 t 检验进行判断(SPSS 16.0 软件),P < 0.05 则认为差异显著。

第四部分 低聚糖对细菌在小鼠肠道内定植的影响

食物中的低聚糖可以进入大肠,被肠道内的细菌分解利用,促进特定细菌的增殖。根据文献报道以及本课题实验的研究结果,低聚糖并非双歧杆菌、乳杆菌等益生菌的专属底物[65],许多种、属的肠道共生菌都具有利用低聚糖的能力[66-68],但不同菌利用低聚糖的能力存在差异,可能与转运蛋白、糖苷酶的活力有关,具体体现在以低聚糖作唯一碳源时的生长快慢上。肠道菌群复杂多样,包括 1,000 多个种,不同菌能利用的碳源种类存在差异,存在底物偏好性,而细菌能利用的碳源种类越多,速度越快,则在肠道竞争中就会处于优势地位,能在肠道中定植下来。为了弄清楚低聚糖利用与细菌在肠道内定植的关系,本章实验主要研究了在体外具有利用低聚糖能力的不同菌株在小鼠肠道内的定植情况。功能性益生菌 Lactobacillusplantarum ST-III 已被证实能利用 FOS,敲除编码 β-果糖苷酶的 SacA 基因后得 ΔSacA 菌株[202],不能利用 FOS,通过比较 ST-III 和 ΔSacA 菌株在肠道内的定植能力,可以反映利用 FOS 对细菌在肠道内定植的影响。因此,本实验选用 FOS 作为研究对象。此外,为了便于检测,采用 SPF 级的 C57BL/6J 小鼠为实验动物,选用分离自健康成人粪便的能利用 FOS Escherichia coli Klebsiella sp.菌株,比较利用 FOS 的能力对菌株在肠道内定植的影响。

实验材料与设备

1试剂

低聚果糖(GFn 型,Meioligo P),上海格信健康科技有限公司;Taq DNA 聚合酶,上海科晴生物科技有限公司;引物合成,生工生物工程(上海)有限公司;其余试剂同第 3 3.2.1

2菌株

Escherichia coli CCFM8335Escherichia coli CCFM8337Escherichia coli CCFM8338Escherichia coli CCFM8415Klebsiella sp. CCFM8371Klebsiella sp. CCFM8375Klebsiella sp. CCFM8376Klebsiella variicola CCFM8387 Cronobacter sakazakiiCCFM8310 分离自健康成人粪便;Lactobacillus plantarum ST-III,由上海光明乳业研究院陈臣提供;ΔSacA 菌株,敲除 SacA 基因(编码 β-果糖苷酶)的 ST-III 菌株,由上海光明乳业研究院陈臣提供。

3培养基

GMM 培养基配制同第二章 2.2.3

4实验动物

SPF 6 周龄 C57BL/6J 雄性小鼠,购于上海实验动物中心。

5主要仪器和设备

电子天平、pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;高压蒸汽灭菌锅MLS-3750,日本 Sanyo 公司;厌氧工作站 Whitley DG250,英国;Bio-Rad T100 PCR 仪、核酸电泳仪、凝胶成像仪,美国 Bio-Rad 公司;紫外可见分光光度计 UV1800,日本岛津公司;其余设备同第三章 3.2.3

实验方法

1动物实验设计

根据表 5-1 的分组情况,将 6 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠随机分配到 14 个组中(5 /组),饲喂于独立通风笼(IVC)系统(江南大学实验动物中心),严格控制 12 h 光照/黑夜,环境温度设定在 22℃;小鼠自由进食、进水,饲料分配按照表 5-1 进行。空白饲料为商品化小鼠饲料;空白饲料经粉碎后,按照 15%的比例添加 FOS,并挤压成球形,制得 FOS 饲料。本动物实验中所用的所有方法均经过江南大学伦理委员会审阅并批准(JN No. 20140306-0910-7),符合欧盟实验动物指南(Directive 2010/63/EU)。表 5-1 动物实验分组Table 5-1 The groups in this experiment编号 分组 适应期 干预期1 空白 空白饲料 空白饲料2 FOS 空白饲料 FOS3 CCFM8415 空白饲料4 CCFM8415 + FOS 空白饲料 FOS5 CCFM8375 空白饲料6 CCFM8375 + FOS 空白饲料 FOS7 ST-III 空白饲料8 ST-III + FOS 空白饲料 FOS9 ΔSacA 空白饲料10 ΔSacA + FOS 空白饲料 FOS11 ST-III + CCFM8415 + CCFM8375 空白饲料12 ST-III + CCFM8415 + CCFM8375 + FOS 空白饲料 FOS13 ΔSacA + CCFM8415 + CCFM8375 空白饲料14 ΔSacA + CCFM8415 + CCFM8375 + FOS 空白饲料 FOS动物实验方案如图 5-1 所示,适应期为 7 天,小鼠进食空白饲料;适应期结束后,开始灌胃细菌或者更换 FOS 饲料,为干预期。按照表 5-1 的分组,适应期结束,给各组小鼠灌胃总量为 1011CFU 的细菌,然后在第 12357 9 天分别收集小鼠粪便,用于判断实验菌株在小鼠肠道内的定植情况。如果能在样品中检测到对应的菌株,则说明该菌株能在小鼠肠道内定植下来。

2粪便样品的收集及细菌基因组提取

灌胃之前(第 0 天),收集各组小鼠的粪便;按照实验分组,各组小鼠灌胃菌株后,在第 12357 9 天分别收集各组小鼠的粪便;将同一天收集的同组小鼠的粪便样品混合在一起,按照 FastDNASpin Kit for Soil 试剂盒说明书提取细菌基因组,参照第三章 3.3.3 描述的方法进行实验,保存于-20℃冰箱。

3细菌菌群组成分析

0天收集的小鼠粪便样品,提取细菌基因组,以细菌基因组为模板,扩增16S rDNAV4 区,PCR 验证, 后进行切胶回收,回收产物按照 Quant-iT PicoGreen dsDNAAssay Kit试剂盒的说明书进行定量(ng/μL),参照第三章 3.3.43.3.5 描述的方法进行实验。根据 PicoGreen 荧光染料的定量结果,按等质量浓度混合样品,样品之间 barcode不重复;按照 Illumina 建库试剂盒 TurSeq DNA LT Sample Preparation Kit 的说明书构建文库,主要包括末端修复、3’端加 A、接头连接以及 PCR 扩增等步骤。文库构建完成后,采用 Agilent Bioanalyzer 2100 测定 DNA 片段大小;按照 KAPABiosystems Library Quantification Kit 试剂盒的说明书,qPCR 法精确测定文库的 DNA 浓度(ng/μL);计算文库的摩尔浓度(nM),参照第三章 3.3.6 描述的方法进行。上机测序前的准备工作、上机测序,参照第三章 3.3.6 描述的方法进行;测序完成后,下机数据处理参照 3.3.7 描述的方法进行。

4细菌利用低聚果糖生长的代时测定

将菌株从-80℃取出后,接种至以葡萄糖为碳源的 GMM 液体培养基中,置于厌氧工作站中 37℃培养 24 h;转接两次后,将处于对数生长期的细菌分别接种至以低聚果糖或者葡萄糖作唯一碳源的新鲜 GMM 培养基中,37℃厌氧培养,每隔 0.5 h 取样,测定菌液在 600 nm 处的吸光度(OD600)。(备注:准确记录样品取出和放入的时间;OD600>0.5 时,适当稀释后测定)根据细菌生长规律,在对数生长期内:At= A0*2(t-0)/G,其中 A0代表进入对数生长期时细菌的初始数量;At表示 t 时刻细菌的数量;G 代表细菌的代时。两端取以 2 为底的对数,则得:log2At= log2A0+ (1/G)*t由此可见,在对数生长期内,log2At与时间 t 呈线性,且斜率为 1/G。因此,细菌的代时 G 是以 log2At为纵坐标、t 为横坐标所得直线的斜率的倒数。

5 E. coliKlebsiella以及L. plantarum ST-III的特异性

PCR扩增以提取的小鼠粪便细菌基因组为模板,利用 L. plantarum ST-III[203]Klebsiella[204]以及 E. coli[205]的特异性引物进行 PCR 扩增(表 5-2),反应体系(50 μL)为:模板 1 μL上游引物(20 uM0.5 μL下游引物(20 uM0.5 μLTaq 0.5 μLTaq buffer 5 μLdNTP 5 μL双蒸水 37.5 μLPCR 反应条件,分别为:1. Lactobacillus plantarum ST-III 以及 ΔSacA945 min9430 s5830 s7230 s35 个循环;7210 min2. Klebsiella945 min9530 s5720 s7220 s35 个循环;7210 min3. Escherichia coli945 min9430 s5030 s721 min30 个循环;7210 min。表 5-2 菌株的特异性引物Table 5-2 Specific primers for the strains序号 菌种 引物 序列(5'-3') 大小1 L. plantarum ST-III上游ST-III-F TTTCGAGTTTGCTTCCTGGGTAT 242下游ST-III-R GTGCCATGTTTAATCTATCTGCTTCAC2 Klebsiella上游K-F ATTTGAAGAGGTTGCAAACGAT 260下游K-R CCGAAGATGTTTCACTTCTGATT3 Escherichia coli上游Eco-F CCGATACGCTGCCAATCAGT 884下游Eco-R ACGCAGACCGTAGGCCAGATPCR 反应结束,进行 1.0%的琼脂糖凝胶电泳,电压 120 V,时间 40~60 min,凝胶成像仪拍照,记录实验结果。

6数据统计与分析

不同组(>3)之间的显著性差异通过进行 ANOVA 进行判断(Tukeys 检验),两组之间的显著性差异通过 t 检验进行判断(SPSS 16.0 软件),P < 0.05 则认为差异显著。

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