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案例范本
益气活血法对前列腺增生模型大鼠治疗机制及Bcl-2表达的影响
添加时间: 2019-4-25 14:54:35 来源: 作者: 点击数:

项目名称:

益气活血法对前列腺增生模型大鼠治疗

机制及Bcl-2表达的影响                 

摘要

良性前列腺增生(BPH)发病机制复杂,细胞凋亡相关基因与该病的发生发展关系密切,B淋巴细胞瘤/白血病-2(Bcl-2)是由前列腺基质细胞产生,以自分泌的形式调节前列腺基质细胞,在前列腺增生的发病过程中起重要作用。目前对Bcl-2在良性前列腺增生发病过程中的调控机制尚不明确,推测Bcl-2过度表达可能是BPH组织细胞凋亡受抑制的主要原因。本实验通过采用雄性去势大鼠睾酮诱导的方法制备前列腺增生模型,从前列腺湿重、前列腺指数、组织病理变化等方面观察,试图阐明BPH发病机制;并重点在分子生物学水平从Bcl-2的表达情况,来探索其具体作用机理,为揭示该病发生发展规律提供新思路。祖国医学认为:气虚血瘀是前列腺增生症的基本病机,益气活血是治疗BPH的基本大法。本课题以益气活血为治疗法则,筛选临床有效的中药复方,对前列腺增生模型大鼠进行治疗,观察治疗后前列腺湿重、前列腺指数、组织病理变化及Bcl-2表达,探讨益气活血中药对前列腺增生的作用机理,并揭示益气活血中药抑制凋亡相关基因Bcl-2表达的作用规律。通过上述研究,鳞选出有效的益气活血类中药复方,为进一步临床研究打下基础,临床治疗提供理论依据。

关键词(用分号分开,最多5个)

益气活血法;前列腺增生;Bcl-2


项目组主要成员

编号

姓名

出生年月

性别

职称

学位

单位名称

电话

电子邮件

项目分工

每年工作时间(月)

01

王波

1957-07-25

高级

学士

贵阳中医学院第二附属医院

08515282638

wangbo1957@126.com

课题设计及监督

8

02

马武开

1960-10

高级

博士

贵阳中医学院第二附属医院风湿免疫科

08515282453

308611089@qq.com

实验指导、生物学技术

8

03

范凯

1982-07-10

中级

硕士

贵阳中医学院第二附属医院

08515282638

kai75822603@163.com

动物实验

6

04

黄从军

1978-11-22

中级

学士

贵阳中医学院第二附属医院

08515282638

hcj4857474@qq.com

病理学技术

6

05

李鹏程

1982-05-26

初级

硕士

贵阳中医学院第二附属医院

08515282638

27216687@qq.com

动物实验

6

06

曾彦艳

1982-06-13

初级

本科

贵阳中医学院第二附属医院

08515282638

xiwang806@126.com

数据收集、统计

5

07

刘彬

1990-07-04

研究生

硕士

贵阳中医学院研究生部

08515282638

stevenlab@163.com

动物实验

8

总人数(人)

按职称

按学位

正高级

副高级

中级

初级

其他

博士

硕士

学士

其他

8

2

1

2

2

1

1

4

3


经费申请表                                   (金额单位:12.00万元)

预算科目名称

科技经费

备注(计算依据与说明)

一、研究经费

12.00万元

1.科研业务费

4.50

(1)测试/计算/分析费

2.50

动物模型1.0; 病理学、免疫组化分析1.50

(2)能源/动力费

0.50

水电、煤气0.2;动物实验室管理费0.3

(3)会议费/差旅费

0.60

参加学术会议;参加学习班等

(4)出版/文献/信息传播

0.80

查新、发表文章、论文编写、成果鉴定等

(5) 其他

0.10

打印材料等

2.实验材料费

5.50

(1)原材料/试剂/药品购置费

4.50

保列治(非那雄胺片)0.5;中药0.5;实验动物1.0;丙酸睾酮注射液1.0;Bcl-2兔抗鼠IgG1.0;DAB显色剂1.0;电子天平秤等0.5。

(2)其它

1.00

购买动物、饲喂、手术等 

3.仪器设备费

0.50

(1)购置

0.50

实验室仪器的保养、维护及管理

(2)试制

4.实验室改装费

5.协作费

1.0

外院实验室协作检验费

二.国内外合作与交流费

1.项目组成员出国合作交流

2.境外专家来华合作交流

3.国内学术交流

三.劳务费

0.40

研究生劳务费

四.管理费

0.60

按规定由学校提取的管理费

合    计

12.00万元

与本项目相关的其他经费来源

国家(省)财政科技计划经费

0.00

部门匹配

0.00

其    他

0.00

合    计

0.00

总   计

12.00万元

正文

(一)立项依据与研究内容:

1.项目的立项依据

1.1项目的研究意义

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasis BPH)简称前列腺增生症,指前列腺组织细胞增多,是老年男性常见病。BPH的病因尚未完全清楚,目前认为BPH的形成可能由雌雄激素失衡;凋亡、抗凋亡基因及增殖基因的异常表达;间质-上皮相互作用和生长因子的刺激等综合因素引起的,但哪个环节是启动因子目前尚不清楚。近年来,细胞凋亡及其相关基因在BPH发病中的作用受到重视,在参与控制前列腺细胞凋亡的基因中,B淋巴细胞瘤/白血病-2(Bcl-2)是目前公认的凋亡抑制因子,bcl-2是由前列腺基质细胞产生以自分泌的形式调节前列腺基质细胞,在前列腺增生的发病过程中起重要作用。但Bcl-2在良性前列腺增生发病过程中的调控机制尚不明确,通过分子生物学水平的研究,揭示其具体作用机制,可为阐明该病发病机制,提供可靠的理论依据。祖国医学认为:气虚血瘀是前列腺增生症的基本病机,益气活血是治疗BPH的基本大法。通过研究益气活血法对前列腺增生治疗机制及Bcl-2表达的影响,可以揭示中药作用机理,为临床推广提供理论指导。

1.2现代医学研究进展

BPH可以导致良性前列腺增大,引起下尿路梗阻。但到目前为止,BPH的发病机制尚未完全阐明。近年来,细胞凋亡及其相关基因在BPH发病中的作用受到重视,细胞增殖和凋亡对于BPH的作用越来越广大学者关注。细胞凋亡又称程序性细胞死亡,指当在一定生理和病理情况下,机体为了维护内环境的平衡与稳定,通过基因调控而使细胞自动消亡的过程。众所周知,正常前列腺组织有其新陈代谢规律,细胞的增殖与凋亡必然要达到动态平衡,才能维持其正常的形态结构和功能,否则细胞的过度增殖或过度死亡都会导致前列腺的增大或萎缩,而事实并非如此。随着人们对疾病的认识深入到分子水平,认为细胞凋亡是一种基本的生物学现象,是个体发育过程中基因调控下的细胞自杀活动,是多细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳定,由细胞内基因控制的细胞主动地程序性死亡过程。凋亡的调控对维持人体组织的自身稳定和形态发育是至关重要的。细胞凋亡的分子机制迄今尚未完全阐明,但研究表明,在细胞凋亡的分子生物学研究中发现有多种基因参与了细胞凋亡的基因调控,这些基因在一定条件下会引起特异型细胞发生与凋亡有关的变化,从而对细胞凋亡进行调控[1]。通过对分子生物学的研究,表明前列腺增生的发生、发展与前列腺细胞的凋亡有关。

细胞凋亡受多种基因的调控,其中bcl-2基因家族备受关注。在参与控制前列腺细胞凋亡的基因中,bcl-2是目前公认的凋亡抑制因子,Bcl一2对各种原因引起的细胞凋亡有抑制作用。1985年由Tsujimoto从伴有14、18 染色体易位的淋巴瘤细胞中发现了Bcl-2即细胞凋亡抑制基因,该基因在正常人体内位于 18 号染色体,在患者则易位于14号染色体[2]Bcl-2家族是一组原癌基因蛋白,该家族主要包括了20余种蛋白质,根据它们在细胞凋亡中作用大致分为两类:一类是抗凋亡蛋白;另一类是促凋亡蛋白,尤以Bcl-2细胞凋亡抑制因子最为重要[3]Bc1-2基因一方面维持细胞生理性分化发育,另一方面则维持着细胞数量的动态平衡,但是,Bc1-2 基因不能反映细胞的增殖能力,只是通过抑制细胞凋亡,延长细胞寿命来促进肿瘤的发生。

1.2.1 BPH中细胞凋亡与bcl-2基因的关系

目前认为细胞凋亡在BPH发生过程中起关键作用[4]。前列腺增生时,前列腺组织中各种增殖和凋亡基因、激素受体、生长因子等表达水平发生改变导致细胞的复制增加(或)死亡的细胞数量减少,进而前列腺组织中总的细胞的数目增加,致使前列腺体积增大。贾彬等[5]睾酮诱导的小鼠的前列腺增生,尽管前列腺增殖指数实验组是对照组的1.5倍,但前列腺细胞的凋亡率与未服药的对照组相比下降了72%。表明前列腺细胞增殖与凋亡都可以引起的前列腺的增生。实验显示,在BPH中存在着Bcl-2高表达和低凋亡共同发生现象。Bcl-2过度表达可能是BPH组织细胞凋亡受抑制的原因之一。

1.2.2 Bcl-2基因在BPH上皮基底细胞中的作用

B淋巴细胞瘤/白血病-2(Bcl-2)是由前列腺基质细胞产生,以自分泌的形式调节前列腺基质细胞,在前列腺增生的发病过程中起重要作用。有研表明正常人的前列腺在干细胞的作用下处于稳态中,使细胞的增生和死亡保持平衡。Erbersdobler 等[6]利用免疫组化测得 Bcl-2 蛋白定位于基底上皮细胞,同时在BPH中呈强阳性表达。并且通过转基因技术在前列腺组织特异性转基因鼠中培养出了人Bcl-2 基因。前列腺基底上皮中人Bcl-2蛋白过度表达明显,同时病理学方面伴有明显的 BPH 改变,说明Bcl-2通过基底细胞发挥其抗凋亡作用,进而延长上皮细胞的寿命。Ramos Soler D等[7]分析比较了34betaE12,p63,bcl-2和α-甲酰辅酶A消旋酶的表达,以评价bcl-2作为前列腺基底细胞病理学的新标记的作用,进而得出结论bcl-2作为一种新的基底细胞标记物具有及其重要的诊断价值。

1.2.3 前列腺各区带之间bcl-2的不同作用

良性前列腺增生(BPH)主要是指前列腺移行带的增生,而外周带很少发生增生。1972年McNeal将前列腺功能及病理变化与形态学联系起来,将前列腺各部分为周边区 ,移行区和中央区。并提出周边区是前列腺癌的常发部位,而移行区是前列腺增生症发生的唯一区域[8]Tang J等[8]获得68名病人接受经直肠超声引导下穿刺活检取得的前列腺周边区和移行区的组织并对其进行免疫组织化学形态分析,对Bcl-2基因的表达进行了评估,发现移行区细胞Bcl-2基因的表达量明显高于周围带和中央带。更有研究结果表明,正常前列腺移行带上皮细胞的增殖率和凋亡率均明显高于外周带。增生的移行带上皮细胞增殖增加,同时凋亡减少。增生的移行带中Bcl-2表达率与上皮细胞凋亡率呈显著负相关[9]。由此可见,细胞增殖和凋亡率在前列腺各区带之间存在差异。增生的移行带上皮细胞凋亡减少,同时细胞增殖增加,这可能是BPH的重要病理基础[10]。包括Bcl-2在内的多种凋亡基因在移行带高表达参与了BPH病理过程[11]。此外,Campos SG[12]等采用对老年性沙鼠随机分成五组进行研究,一组作为空白对照组其余四组在去势后分别给予1、3、7和30天的氟他胺治疗,该疗法促进了老年鼠病灶减少,并观察到在治疗30天的沙鼠的前列腺组织中存在Bcl-2阳性细胞,表明Bcl-2基因的表达与雄性激素之间存在一定的联系。

通过以上的研究证明,Bcl-2在前列腺组织中的表达水平对于协调前列腺组织细胞的增殖与凋亡有着积极的作用。Bcl-2作为一种新型原癌基因[12],其对细胞凋亡具有直接抑制作用。免疫组化显示Bcl-2定位于基底上皮,在BPH强阳性表达。Bcl-2对基底细胞发挥抗凋亡作用且延长非增殖细胞的存活时间,结果是造成前列腺内细胞绝对数目的增加,并最终形成BPH。与此同时,前列腺移行带上皮细胞凋亡减少的与Bcl-2过高表达也有着重要的联系。

 上述研究存在的问题:Bcl-2在前列腺增生的发病过程中起着重要作用,但人们对其如何调节细胞凋亡的作用机制尚不完全清楚,相信随着对凋亡基因及其调控机制的研究和对整个凋亡分子生物学过程的了解,人们将利用基因转移及基因调控技术做到控制细胞凋亡,这将对了解Bcl-2基因在BPH的形成过程中所起的作用以及BPH的治疗产生深远的影响。

1.3 祖国医学研究进展

1.3.1病因病机

良性前列腺增生归属于祖国医学“癃闭”、“精癃”范畴。中医学认为,年老体衰、肾气亏虚是前列腺增生症的发病基础, 瘀血、痰浊、湿热是基本的病理因素,劳力过度、情志刺激、外感六淫、饮食不节是常见的发病条件,本虚标实是基本病机特点。

气虚血瘀是BPH的基本病机:血液的运行,有赖之元气推动,«读医随笔»指出:“气虚不足以推血,则血必有瘀”,前列腺增生多发生于老年气虚之人,气虚不足,推动无力,血循不畅,停而为瘀。«医林改错»说:“元气及虚,必不能达于血管,血管无气,必停留而瘀”。«景岳全书»说:“凡人之气,血扰如源泉也,盛则流畅,少则壅滞,故气血滞,虚则无有不滞者”。王清任«医林改错»云:“无论何处,皆有气血,气无形不能结块,结块者必有形之血也”。说明增生的腺体为血瘀所致。现代研究表明:气虚血液粘滞性增加,导致血流缓慢,血液瘀滞。

范洪力[13]认为肾、脾、膀胱是良性前列腺增生症的主要病位,“肾、脾、虚、湿、瘀”是前列腺增生发生下尿路症状的5个关键因素。徐福松教授[14]认为,本病的发生是因虚而致实,肾虚是发病的主要原因,是发病之本;血瘀下焦是发病之标。膀胱湿热和肺热气闭分别是前列腺增生症的诱因和伴随证型。徐浩等[15]认为,前列腺增生的主要原因在于肾气虚衰、脾虚、中气不足和水道瘀阻,多以肾虚为本,湿热、气滞、痰凝、血瘀为标。刘海生[16]认为,前列腺增生患者因年高体弱,肾气不足,膀胱统摄无权,气化不利,清气不升,浊气不降,而致癃闭。魏道样[17]认为,肾气虚弱为病之本,排尿困难为病之标,瘀血阻滞是共同的病理环节。何清湖[18]通过审症求因、临床验证、微观辨证三个不同层面探讨良性前列腺增生的病因病机,认为肾虚是发病的基本条件,与现代医学年老发病的基本条件相吻合,血瘀是前列腺腺体增生病理改变的关键,肾虚、血瘀相互影响,构成前列腺腺体增生的病理机制。

综上所述,本病的病位虽在前列腺,但与肺、脾、肝、肾及三焦密切相关,肺、脾、肾功能不全及三焦气化功能失调,致津液输布失常,生湿生痰,或肝郁气滞血瘀,阻塞尿道。病机以本虚为主,本虚以肾气亏虚为主;标实为湿、热、气滞、血瘀、痰阻;因久病入络,腺体增生,气血运行不畅,故标实又以血瘀为主。气虚、血瘀构成BPH发病的两个最重要因素。

1.3.2 辩证施治

益气活血是治疗BPH的基本大法。气虚血瘀是前列腺增生症的基本病机,虚则补之,实则泻之,血实者宜决之,因此,治疗前列腺增生症的基本大法为益气活血。对前列腺增生所致的症状,中医辨证治疗的报道甚多,但临床分型涉及五脏六腑,临床应用不易掌握其要领。现代医家经多年的临床实践认为气虚、血瘀是BPH发生两个重要因素,是BPH发生的主要病理机制,现代医学证实,活血化瘀药具有改善微循环,抗血小板凝集,促进纤溶,扩张血管作用,所以在治疗前列腺增生中起主要作用。临床许多医家以益气活血为主的方药治疗BPH都收到了良好的效果.如张英杰等[19]用中药穿山甲等活血化瘀消肿药治疗BPH,岳建平等[20]采用补肾活血法治疗BPH,贾金铭与刘敬方经过多年临床实践及药理研究,结合老年人体质特点,研制的消瘀通闭胶囊,经实验研究表明具有抑制大鼠前列腺组织上皮及间质细胞的生长因子[21] [22]的作用。临床上对增大的前列腺压迫引起尿道部前列腺梗阻(静力因素),平滑肌导致的张力因素(动力因素)以及膀胱逼尿肌的收缩无力等均有较好的治疗作用。这种认识与传统中医理论亦较为吻合。董襄国教授[23]认为应注重益气活血,因老年人肾气虚,董教授的前列汤正是在此基础上所拟,其药物组成为:黄茂30 当归12 熟地黄30 淫羊蕾15 肉桂5 炮山甲片12 王不留行子15 车前子10 泽泻10 茯苓15。寇吉友等[24]采用去势后大鼠腹腔注射丙睾复制BPH模型,运用电针结合金匮肾气丸进行治疗,以平调阴阳,活血通络,振奋元阳,助膀胱气化而利水,疗效颇佳。赵冬等 [25] 采用温阳通络法对前列腺增生症相关基因组的实验研究,证实温阳通络法对大鼠前列腺增生有明显的治疗作用能够明显下调大鼠前列腺组织bcl-2基因表达促进前列腺细胞凋亡,疗效显著。

综上所述,良性前列腺增生的基本病机为气虚血瘀,益气活血为其主要治疗法则,有学者通过实验研究中药对大鼠前列腺组织上皮及间质细胞因子的作用,来阐述中药的作用机理,但未形成系统理论,通过研究益气活血法对前列腺增生发病过程中Bcl-2影响的作用机制,尚未有人涉及。

1.4 立项依据

   良性前列腺增生发病机制复杂,细胞凋亡及其相关基因与该病的发生发展关系密切,有深入研究的价值。

    B淋巴细胞瘤/白血病-2(Bcl-2)是由前列腺基质细胞产生,以自分泌的形式调节前列腺基质细胞,在前列腺增生的发病过程中起重要作用。Bcl-2对基底细胞发挥抗凋亡作用且延长非增殖细胞的存活时间,结果是造成前列腺内细胞绝对数目的增加,并最终形成BPH。与此同时,前列腺移行带上皮细胞凋亡减少的与Bcl-2过高表达也有着重要的关联。本课题由此切入研究,目标明确。

    Bcl-2在良性前列腺增生发病过程中的调控机制尚不明确,通过分子生物学水平的研究,揭示其具体作用机制,可为阐明BPH发病机制,提供可靠的理论依据。本课题组曾开展Bcl-2等相关因子在白血病方面表达的研究,本课题在实验方法和技术上诸多方面可以借鉴。

   气虚血瘀是前列腺增生症的基本病机,益气活血是治疗BPH的基本大法。通过前期的临床验证,疗效确切,假想其能通过影响Bcl-2表达而产生作用

   本课题尝试将益气活血法对前列腺增生发生发展过程中细胞凋亡及其相关基因的影响,可能取得意想不到的效果,可以通过中药对Bcl-2表达的影响,探讨其作用机制,为临床推广提供理论指导。

参考文献:

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24 寇吉友,卫彦,杨福彪,.电针结合金匮肾气丸对良性前列腺增生大鼠前列腺中凋亡调控因子的影响[J].中国民间疗法,2011, 19(5):70-71

    25 赵冬黄正宇林谋清等.温阳通络法对前列腺增生症相关基因组的实验研究. 时珍国医国药,2012 723):1846-1847.

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 2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。

研究内容

以雄性去势大鼠睾酮诱导的方法制备前列腺增生模型。

观察模型组前列腺湿重、前列腺指数、组织病理变化及凋亡相关基因Bcl-2的表达情况。

通过益气活血中药治疗,观察中药对前列腺湿重、前列腺指数、组织病理变化及凋亡相关基因Bcl-2表达的影响。

研究目标

通过益气活血法对前列腺增生模型大鼠治疗,从以下几方面探讨BPH发病机制及中药作用机理,为临床治疗该病提供理论依据。

通过观察模型组前列腺湿重、前列腺指数、组织病理变化及Bcl-2的表达情况,探讨良性前列腺增生发病机制。

通过观察益气活血法对前列腺增生模型大鼠治疗后前列腺湿重、前列腺指数、组织病理变化及Bcl-2表达的影响,探讨益气活血中药作用机理。

通过对比观察Bcl-2表达情况,探讨凋亡相关基因Bcl-2BPH发病中的作用机理,是否起着关键作用。

通过研究,鳞选益气活血中药,为下一步临床研究打下基础,临床治疗提供理论依据。

项目拟解决的关键问题

理论上拟解决的关键问题

细胞凋亡在BPH发生过程中起关键作用,细胞凋亡受多种基因的调控,bcl-2是否为前列腺增生的发病过程中的重要因子。

Bcl-2在良性前列腺增生发病过程中的调控机制:Bcl-2过度表达可能是BPH组织细胞凋亡受抑制的原因之一,Bcl-2可能通过前列腺基底细胞发挥其抗凋亡作用。 

益气活血中药作用环节:可能通过抑制Bcl-2的过度表达,降低前列腺细胞的增殖对大鼠前列腺增生产生作用,从而起到较好的治疗效果。

技术上拟解决的关键问题

 保证各实验组间的平行性和资料的可比性;

保证造模的可靠性和可重复性。

保证免疫组化的可靠性

3.拟采取的研究方案及可行性分析。

研究方法

用雄性去势大鼠睾酮诱导的方法制备前列腺增生模型。

造模成功后将雄性SD大鼠随机分为模型组、保列治组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组。

测定各组前列腺湿重及前列腺指数。

通过HE染色观察大鼠前列腺增生组织病理变化。

运用免疫组织化学法观察前列腺组织中Bcl-2蛋白表达的变化。

实验方案

1)益气活血法中药复方及分析

治则:益气活血,通阳利水

处方:黄芪30 桃仁20 桂枝15 茯苓15 丹皮15 川牛膝15 荔枝核10 肉桂6

方解:黄芪益气固表,桃仁活血祛瘀,二药共为君药;桂枝温阳化气,茯苓健脾益气,丹皮散血行瘀,牛膝补益肾气、活血化瘀,共为臣药;荔枝核行气消癥,肉桂温肾助阳化气行水。以上诸药合方,具补益肾气,活血化瘀,通利水道之功效。

2)动物分组与模型制备

拟先将95只清洁级雄性SD大鼠随机分为二组,假手术组10只,造模手术组85只。造模手术组大鼠均切除双侧睾丸,假手术组动物麻醉后剪开外阴皮肤后立即缝合,作假手术处理,大鼠经自然恢复1周。切除睾丸各组大鼠皮下丙酸睾丸酮5mg/kg/只,假手术组大鼠皮下注射生理盐水0.1ml/只,每日1次,1周后处死全部假手术组大鼠,造模手术组随机取10只大鼠处死,摘除前列腺,计算前列腺指数,统计数据验证假手术组与模型组是否具有显著性差异,证明造模成功。其余造模手术大鼠随机分为益气活血中药高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组、保列治组、每组动物数为10只。

3)给药方法

造模后给药干预的各组大鼠皮下注射橄榄油溶的丙酸睾丸酮 5mg/kg/只,同时测定动物体重,计算给药量后开始给药,以后每10天测体重1次,以便调整药量,等效剂量以成人常规剂量按人与动物体型系数折算并根据文献,中药组高、中、低剂量组分别为0.9g/kg、0.3g/kg、0.1g/kg,研碎后溶于水灌胃给药,保列治组经折算后按0.5mg/kg溶于水灌胃给药,模型组只给与等量的蒸馏水灌胃,均每日1次,连续给药4周。

4)标本采集及前列腺湿重测定

末次给药后24小时天平称取各组大鼠重量后断头处死,仔细剖取前列腺组织并迅速电子天平称重,立刻于4%多聚甲醛溶液中固定备用。

5)计算前列腺指数

用取得的各组实验鼠体重和前列腺湿重计算前列腺指数(前列腺指数=前列腺湿重mg/大鼠体重g)。

6)HE染色观察前列腺组织病理变化

将己入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟;酸水及氨水中分色,各数秒钟;流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻;入70%和90%酒精中脱水各10分钟;入酒精伊红染色液染色2~3分钟;脱水:梯度酒精脱水;透明和封片:二甲苯透明后,迅速擦去材料周围多余液体,滴加适量(1~2 滴)中性树胶,再将洁净盖玻片盖上;显微镜观察结果。

7)免疫组织化学法观察Bcl-2的表达

载玻片预先用防脱片剂多聚赖氨酸处理,前列腺组织石蜡切片捞片置烤箱60℃烤片60min,使切片紧密粘附,石蜡切片常规脱蜡;

1%过氧化氢水溶液处理,灭活内源性酶;

微波修复抗原;

抗原修复液1滴加在切片上,室温10min后,PBS洗涤2~3次;

滴加正常山羊血清封闭液,室温20min,甩去多余液体,不洗。滴加兔抗Bcl-2,4℃过夜,PBS洗涤3次×4min;

滴加生物素化二抗(山羊抗兔IgG),37℃20min,PBS洗涤3次×4min。滴加SABC试剂,37℃20min,PBS(PH7.2-7.6)洗涤5min×4次;

微量移液器吸取蒸馏水1ml,加显色剂A,B,C各1滴,混匀;

吸取50µl混匀后的显色剂加至切片,室温显色,镜下控制反应时间5~30min之间,显色完毕后蒸馏水充分洗涤以终止反应;

苏木素轻度复染1min左右,水洗;乙醇脱水、二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察阳性染色情况;

 采用彩色病理图像分析系统,通过光学显微镜摄取图像,输入图像分析系统内,对图像进行灰度变换,使阳性面积与背景分开,进行自动测量。对每例切片随机选取 10 个不重叠视野,计算Bcl-2的阳性表达的面密度值即阳性面积和整个视野面积的比值,取其平均值进行比较。

8)统计方法

应用SPSS17.0软件进行统计分析,实验数据以均数±标准差(x±s)表示,进行单因素方差分析及LSD检验,若P<0.05认为差异具有显著性,P<0.01认为差异具有高度显著性

技术路线

可行性分析

理论上的可行性

细胞凋亡在BPH发生过程中起关键作用,bcl-2是前列腺增生的发病过程中的重要因子,Bcl-2可能通过前列腺基底细胞发挥其抗凋亡作用,Bcl-2过度表达可能是BPH组织细胞凋亡受抑制的主要原因,通过研究,可以揭示Bcl-2在良性前列腺增生发病过程中的调控机制。

良性前列腺增生的基本病机为气虚血瘀,益气活血为其主要治疗法则,通过研究益气活血法对前列腺增生发病过程中Bcl-2影响的作用机制,可以揭示益气活血中药抑制凋亡相关基因Bcl-2表达的作用规律。

实验设计上的可行性

本课题实验设计方案合理,流程简洁,具备可操作性与可重复性。

研究方法和研究方案的可行性

本课题具备较好的前期工作基础:通过益气活血法对前列腺增生模型大鼠治疗,探讨BPH发病机制及中药作用机理,研究目标切实。并做了一些前期工作,如文献查阅、理论研究等,并对涉及前列腺相关疾病的细胞因子做过实验及临床研究,项目组成员做过解毒化淤药对白血病K562/A02、HL60/Adr细胞P-gp、Bcl-2、P53基因表达影响的研究,对Bcl-2基因研究较为深入,为实施本课题奠定了良好的基础。

课题组有前列腺动物模型的制备经验,对该实验涉及的动物造模方法、药物的制备及给药方法、取材方法、HE染色及组织病理改变、免疫组化流程熟悉,能保证实验的顺利进行。

课题组能保证材料来源的可靠性,包括实验动物大鼠、免疫组化试剂盒等。

课题组能保证满足该课题的相关实验条件:贵阳中医学院动物实验研究所能提供动物实验场地及设备以满足动物实验顺利进行;贵阳中医学院第二附属医院病理科可提供病理观察相关设备并可提供人员帮助以保证HE染色步骤正确性及观察结果的可靠性;贵阳中医学院第二附属医院中心实验室具备了良好的分子生物学和细胞生物学技术平台,也具有先进完善的仪器设备,可提供免疫组化相关技术人员、设备及技术支持。

本课题项目组团队年轻优秀:课题申请者具备较强的科研工作能力,对该项目研究有一定的前期工作基础; 课题组成员结构合理,涵盖了本课题所需的各级的人才。

4.本项目的特色与创新之处。

首次提出益气活血法,并全面探讨其对BPH具体作用机制。

首次观察益气活血中药对对前列腺增生模型大鼠Bcl-2表达的影响,探讨其作用环节及干预机制。

5.年度研究计划及预期研究结果。

年度研究计划

2014年9月-2015年1月  完成实验材料及试剂的准备,查问资料,文献检索,实验方法的收集准备

2015年2月-2015年8月  实验动物的饲养及观察、动物模型的制备、实验分组及给药、标本取材及保存固定、前列腺湿重的测定及前列腺指数的观察。

2015年9月-2016年1月   HE染色观察前列腺组织病理变化

2016年2月-2016年8月   免疫组织化学法观察Bcl-2的表达

2016年9月-2017年9月   数据整理、统计、分析,课题总结,发表论文。

预期研究结果

理论成果:bcl-2是前列腺增生的发病过程中的关键因子,Bcl-2通过前列腺基底细胞发挥其抗凋亡作用,Bcl-2过度表达可能是BPH组织细胞凋亡受抑制的主要原因。益气活血中药通过抑制凋亡相关基因Bcl-2表达而产生良好的治疗作用。

技术方法:完善益气活血中药治疗前列腺增生的实验方法及手段,为临床研究推广提供依据。

 文:拟在国内核心期刊发表论文1-2篇。

人才培养:通过该研究,拟培养硕士研究生1名。

(二)研究基础与工作条件

1、 工作基础。

本课题具备较好的前期工作基础:项目组团队年轻优秀,课题申请者具备较强的科研工作能力,对该项目研究有一定的工作基础; 课题组成员结构合理,涵盖了本课题所需的各级的人才。些前期工作,如文献查阅、理论研究等,并对涉及前列腺相关疾病的细胞因子做过实验及临床研究,项目组成员做过解毒化淤药对白血病K562/A02、HL60/Adr细胞P-gp、Bcl-2、P53基因表达影响的研究,对Bcl-2基因研究较为深入,为实施本课题奠定了良好的基础。

课题组有前列腺动物模型的制备经验,对该实验涉及的动物造模方法、药物的制备及给药方法、取材方法、HE染色及组织病理改变、免疫组化流程熟悉,能保证实验的顺利进行。

2、工作条件。

实验条件:本单位中心实验室能基本满足本实验开展所需一切条件,在免疫组化方面有扎实的工作基础。现有设备有:切片机、细胞图像分析系统、光学显微镜、全自动免疫组化染色仪、-20、-80度低温冰箱 、抗原修复架、抗原修复微波炉、常温离心机、电热恒温鼓风干燥箱 、BS200S电子精密天平等。

实验模型的建立:项目组对前列腺动物造模的基础,熟悉基本流程,贵阳中医学院动物实验研究所可提供饲养及实验场地,可以保证动物模型的制备成功。

需解决的实验条件:本项目中所需主要仪器设备已基本具备,根据具体要求,部分设备需购置某些零配件,以满足实验要求。但需要购买较多实验试剂如化学试剂、保列治(非那雄胺片)、丙酸睾酮注射液、Bcl-2兔抗鼠IgG、DAB显色剂等。此外需要购买饲养实验动物。对活血化瘀中药的制备:由本单位药房提供中药原材料,由项目组制备中药高、中低剂量。

 

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